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金黄色葡萄球菌OatA基因敲除菌株及其回补菌株的构建
目的:构建金黄色葡萄球菌(金葡菌)OatA基因敲除菌株及其回补菌株.方法:以pBT2为载体,构建金葡菌OatA基因敲除质粒pBT2-△OatA,经金葡菌RN4220修饰后电转入金葡菌USA300,利用pBT2载体对温度敏感的特点,在42℃多次传代,筛选出金葡菌OatA基因敲除菌株.以pLI50为载体,构建pLI50-OatA全基因回补质粒,电转入金葡菌RN4220,再次抽提后电转入敲除菌株△OatA,获得基因回补菌株pOatA.结果:成功构建基因敲除质粒pBT2-△OatA,经RN4220修饰电转入USA300,经PCR及测序鉴定,获得了金葡菌OatA敲除菌株△OatA.经PCR及酶切鉴定,确认pLI50-OatA回补质粒构建成功,通过金葡菌RN4220修饰后电转入敲除菌株△OatA,获得基因敲除回补菌株pOatA.结论:成功构建金黄色葡萄球菌OatA基因敲除菌株及其回补菌株,为进一步研究金葡菌OatA的功能及其作用机制奠定基础.
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肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株和回补株的构建
目的 利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD33质粒为载体的espF基因回补实验平台.方法 设计1对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46质粒的EDL933w,在PKD46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株.采用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录.结果 构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录.结论 本研究运用Red重组t系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础.
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副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用
目的：建立以pBAD33质粒为载体的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, VP）基因回补实验平台。方法PCR扩增aphA和opaR的整个ORF区序列，并将其直接克隆入pBAD33质粒中，构建重组质粒。分别将重组质粒转入到ΔopaR和ΔaphA中（分别代表opaR和aphA的突变株），以构建出相应的回补株C-ΔaphA和C-ΔopaR。分别在aphA和opaR基因内设计特异性引物，采用RT-PCR方法，验证在相应的回补突变株中aphA和opaR是否转录。利用引物延伸实验研究野生株（WT）、ΔopaR、ΔaphA、C-ΔaphA和C-ΔopaR中mfpA（aphA负调控，opaR正调控其表达）的相对RNA水平。结果 aphA和opaR在相应的回补株中发生转录；且mRNA水平与野生株一致。结论成功建立了以pBAD33质粒为载体的VP基因回补方法，并得到应用。
