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反义RNA的作用机理及其在植物基因工程领域的应用
本文综述了反义RNA在原核生物和真核生物中的作用机理,并系统地介绍了反义RNA技术在植物基因过程中的研究进展.
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反义RNA阻断Hep G2细胞FasL的表达及功能研究
应用分子克隆技术将人FasL cDNA片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN,构建重组质粒pL(hFasL-AS)SN,转染包装细胞PA317后获得FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体假病毒上清,经NIH3T3细胞检测其感染滴度后转染肝癌细胞株Hep G2细胞并筛选建系,命名为Hep G2-hFasL-AS.半定量RT-PCR检测显示Hep G2-FasL-AS细胞FasL的mRNA明显少于正常Hep G2细胞;FACS检测显示Hep G2-FasL-AS细胞FasL的表达与Hep G2细胞相比显著下降;同时,Hep G2-FasL-AS细胞导致HL-60细胞凋亡能力有所下降.表明人FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体能抑制转染细胞FasL的表达并下调其致凋亡功能.
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应用AdEasy系统构建携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的实验研究
目的:应用腺病毒载体AdEasy系统构建携带反义多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)的重组腺病毒载体.方法:将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183体内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp.结果:成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒载体系统,经测定病毒滴度可达2.5×109efu/ml,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100时对SMMC7721/ADM细胞株转导效率可达90%以上.结论:腺病毒载体AdEasy系统能简便、有效地产生重组腺病毒,且生成的病毒滴度高、转导效率好,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础.
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携带反义多药耐药基因的重组腺病毒载体的构建
从携带有全长人类MDRl cDNA的质粒pHaMDRl-1获得MDRl基因片段,将其反向克隆到腺病毒载体AdEasy系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,经293细胞包装生成携带反义MDRl基因片段的重组腺病毒AdEasy-GFP-asMDRl,可以有效地感染人肝癌耐药细胞株,为进一步研究逆转肝癌多药耐药性的机制提供了基础.
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携反义二型基质金属蛋白酶基因的重组腺病毒的构建
目的构建携带反义二型基质金属蛋白酶(MMP2)基因的重组腺病毒.方法从新鲜肝癌组织中提取总RNA,用RT-PCR法合成MMP2 cDNA序列中5′端转录起始位点附近长约500 bp的基因片段,将此片段反义克隆到腺病毒载体(AdEasy)系统的多克隆位点,经转染293细胞生成携带反义MMP2基因的重组腺病毒Ad-MMP2As.结果成功构建并包装携带反义MMP2基因片段的重组腺病毒Ad-MMP2AS,病毒滴度达1×108/ml.结论构建的重组腺病毒Ad-MMP2As可望能有效地将反义MMP2基因片段导入人肝癌细胞株,为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及探讨抑制肝癌浸润和转移的方法提供实验基础.
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携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的构建及其应用的初步研究
目的构建携带反义多药耐药相关蛋白(MRP)的重组腺病毒并转染人肝癌耐药细胞株,为肝癌耐药的基因治疗提供实验研究基础. 方法将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在细菌体内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp,再用其转染人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM.结果成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒,病毒滴度为2.5×109 efu/ml,多重感染复数为100时对SMMC-7721/ADM细胞株转导效率可达90%以上.结论构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株,为肝癌耐药机理及其逆转方式的研究提供实验基础.
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靶向murA反义工程菌的构建
目的 应用反义RNA沉默技术,构建针对murA基因的超敏工程菌.方法 将不同murA基因片段插入带有pairedtermini结构的反义表达载体pHN678中,获得重组质粒,导入大肠埃希菌宿主诱导表达.通过生长表型考察不同反义片段对murA沉默效果的影响,并用靶向MurA抑制剂磷霉素验证反义工程菌E.coli DH5α/pHNM2的敏感性及靶向性.结果 反义片段murA1和murA2具有较好的沉默效果,E.coli DH5α/pHNM2对MurA抑制剂磷霉素具有靶标特异性和敏感性.结论 成功获得靶向murA反义工程菌Ecoli DH5 α/pHNM2,并有望进一步应用于MurA特异性抑制剂高通量筛选模型的构建.
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抗革兰阴性菌靶向筛选平台的建立
目的 建立靶向筛选抗革兰阴性菌新药的综合模型体系.方法 以大肠埃希菌DH5α菌株作为革兰阴性菌的模式菌,利用反义RNA沉默技术特异性降低靶基因的表达水平,构建系列反义RNA低表达菌株,并基于这些菌株构建靶向抗菌筛选平台.结果 建立了针对72个菌体生长的必需基因,10余个途径的全细胞筛选模型,形成可全面评价化合物活性位点的模型体系.对已知药物进行了模拟筛选和靶点评价,证实了筛选体系的可靠性.结论 利用本文建立的筛选体系,可完成抗革兰阴性菌靶向药物筛选和机制评价两个功能.
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携反义基质金属蛋白酶-2的重组腺病毒对肝癌生长的影响
目的探讨携带反义二型基质金属蛋白酶(MMP2)基因的重组腺病毒(Ad-MMP2AS)对人肝癌细胞株(Bel-7402)体外侵袭性和人肝癌动物模型生长的抑制作用.方法用已构建的Ad-MMP2AS感染人肝癌细胞株(Bel-7402),用侵袭小室模型检测Ad-MMP2AS对Bel-7402细胞降解人工基底膜的抑制作用;用Western Blot和明胶酶谱检测Ad-MMP2AS对Bel-7402细胞分泌MMP2的影响;用感染了Ad-MMP2AS的Bel-7402细胞接种于裸鼠皮下,使其在裸鼠体内成瘤,以观察其成瘤能力;用Ad-MMP2AS瘤内注射,以观察它对肝癌生长的抑制作用.结果 Ad-MMP2AS感染的Bel-7402细胞分泌MMP2被抑制、穿过人工基底膜Matrigel的Bel-7402细胞数下降52%、感染Ad-MMP2AS的Bel-7402细胞的成瘤量下降4.3倍,Ad-MMP2AS瘤内注射后瘤体生长减少63%.结论 Ad-MMP2AS能明显抑制肝癌的生长,对肝癌有治疗潜力.
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携反义mrp和mdr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定
目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(mrp)和反义多药耐药基因(mdr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(MDR)的研究.方法将mrp基因cDNA5′端500 bp的基因片段与mdr1基因cDNA5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(mrp+mdr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV Helper-Free System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(mrp+mdr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(mrp+mdr1)AS与AAV Helper-Free System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV2-(mrp+mdr1)AS.结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV2-(mrp+mdr1)AS,病毒滴度达2.5×108 efu/ml.结论构建的rAAV2-(mrp+ mdr1)AS可望能将反义mrp和mdr1基因片段导入HCC耐药细胞株.
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携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建
目的构建携带反义多药耐药相关蛋白(MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究.方法将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp.结果成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒载体系统,经测定病毒滴度可达2.5×109. 结论构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础.
