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切应力对联合培养的血管内皮细胞F-肌动蛋白排列的影响
与平滑肌细胞联合培养的血管内皮细胞在静态时形态就开始发生变化,即由单独培养条件下在的多边形到联合培养条件下的长梭形.切应力作用下,联合培养的内皮细胞的形态在较短时间内发生更进一步的变化.F-actin在维持细胞形态及使内皮细胞与细胞外基质的粘附上起着重要的作用.为了探讨切应力对联合培养的血管内皮细胞F-肌动蛋白的排列的影响,本文应用平滑肌细胞与内皮细胞联合培养模型,将牛主动脉平滑肌细胞和内皮细胞进行联合培养,待内皮细胞形成单层后,用平行平板流动腔,将内皮细胞置于40dyn/cm2稳定层流切应力之下12、24小时,然后用罗丹明标记的鬼笔环肽标记,激光共聚焦扫描显微镜观察内皮细胞骨架F-肌动蛋白的组成及排列形式的变化情况,并与静态条件下单独培养及联合培养的内皮细胞F-肌动蛋白的排列作对照分析.
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切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导
目的:现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8 mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法:4.2 dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4 mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果:切应力作用0.5 h后IL-8 mRNA表达逐渐增高,2 h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2 dyn/cm2层流切应力作用10 min后磷酸化IκB水平即显著增加,30 min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1 h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2 dyn/cm2切应力作用0.5 h后内皮细胞核逐渐着色,1.5 h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4 mRNA,在4.2 dyn/cm2切应力作用1 h后TLR-4 mRNA的表达显著增强,而TLR-2 mRNA的表达变化不明显.结论:流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4 mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.
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流体切应力对内皮细胞IL-8基因表达的影响及信号转导
目的流体切应力对于维持血管的稳定有着重要的作用.另外在一些病理情况下,例如动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发病过程中,流体切应力也扮演着关键角色.我们以往的实验结果证实:以低流体切应力(4.2dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞1 h,其IL-8mRNA的表达上调;处理2 h其表达量上调更为明显.在本实验中我们将进一步阐明流体切应力对培养的人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达、蛋白生成的影响及其信号转导途径.方法分别用实时定量RT-PCR及定量三明治ELISA检测IL-8基因表达及蛋白生成;通过基因转染及流式细胞数检测IL-8报告基因pEGFP1-IL8USCS经流体切应力作用后的激活情况;用免疫荧光化学染色观测对照和层流切应力处理以后NF-κB核转移情况;将对照和层流切应力处理后的内皮细胞裂解物进行I-κB和磷酸化的I-κB的免疫印迹实验,以检测切应力诱导的I-κB磷酸化和降解的情况;RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色观察TLR-4和TLR-2在人脐静脉内皮细胞上的表达;用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增胞内区段缺失突变TLR-4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDNA3,构建重组TLR-4胞内缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4,与pEGFP1-IL8USCS共转染内皮细胞,流式细胞术观察mTLR4对切应力诱导IL-8报告基因表达的影响.结果和讨论(1)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,1 h IL-8 mRNA表达增加,2 h IL-8 mRNA表达量至高值,3 h IL-8 mRNA表达量开始下降,4 h后IL-8 mRNA持续相对高表达;各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8 mRNA随时间的变化规律,即IL-8的表达对切应力有时间依赖性.(2)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,低切应力时IL-8 mRNA表达量明显增加,高切应力时IL-8 mRNA表达量较低.IL-8 mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;不同的切应力作用时间(1、2 h)均表现出相同的IL-8 mRNA随切应力强度的变化规律.提示流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8,不仅与切应力的作用时间有关,而且IL-8的表达量与切应力作用强度有关,两者之间具有明显的直线负相关.直线回归方程:1 h时为y=7.57-0.11x,相关系数r=-0.97;2 h时为y=7.92-0.10 x,相关系数r=-0.96.(3)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞1 h后,IL-8蛋白质生成量增加,处理5 h后IL-8蛋白质生成量增加至高值,处理8 h后IL-8蛋白质生成量下降,10 h后IL-8蛋白质生成量维持在一个较高的水平.各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力作用时间的变化规律.提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成IL-8,并且IL-8的生成量与切应力的作用时间有关,呈双相性变化.(4)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.23 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量明显增加,为高切应力(19.29 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的约6(作用5h)或7倍(作用6h).IL-8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程:5 h时为y=760.12-36.06x,相关系数r=-0.978;6 h时为y=781.87-36.66x,相关系数r=-0.980.(5)pEGFP1-IL8USCS转染细胞,层流切应力刺激3 h后IL-8报告基因绿色荧光蛋白表达增强.(6)NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示,切应力刺激0.5 h,胞核即出现阳性反应,刺激1.5 h后,胞核呈强阳性染色.(7)细胞裂解物免疫印迹显示,刺激10 min时磷酸化IκB即显著增强,1 h后磷酸化IκB印迹强度降到无,而IκB随刺激时间延长而逐渐降低,0.5和1 h后降至测不到IκB.(8)免疫荧光细胞化学染色显示脐静脉血管内皮细胞膜表达TLR-4.RT-PCR和Northern杂交显示,人脐静脉血管内皮细胞表达TLR-2和TLR-4 mRNAs;当切应力刺激1 h后,TLR-4 mRNA表达明显增强.pcDNA3-mTLR4和pEGFP 1-IL8USCS共转染细胞,层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强.本实验中我们采用的切应力为2.23、4.20、6.08 dyne/cm2,这些切应力与动脉血管分叉处等低切应力区生理切应力大小相似,在这些低切应力区,血管内皮细胞可分泌IL-8,IL-8转而激活中性粒细胞和单核细胞,调控它们和内皮细胞的黏附,这将触发一系列的病理变化,例如:动脉粥样硬化等.结论流体切应力诱导内皮细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8蛋白的生成,在感染及动脉粥样硬化等病理过程中扮演着重要角色.
