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利什曼原虫动基体DNA及其应用
利什曼原虫具有独特的线粒体一动基体,动基体含有巨大网状DNA(动基体DNA).动基体DNA具有许多独特的特征,已广泛用于利什曼原虫虫种的鉴别和利什曼病的临床诊断.该文就这些方面的研究进展作一综述.
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检测动物棘球蚴的3种PCR方法的比较
目的 比较多重PCR(muhiplex PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、半巢式PCR等3种检测棘球蚴的PCR方法,优化可区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株(G1型)和骆驼株(G6型)、石渠棘球绦虫和带科绦虫的方法.方法 根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫、带科绦虫线粒体基因序列,用DNAStar软件设计半巢式PCR通用引物,建立半巢式PCR法,并与文献报道的多重PCR法、PCR-RFLP平行扩增3份巨颈绦虫囊尾蚴、48份多房棘球蚴、8份细粒棘球蚴样本DNA,比较3种检测方法的特异性和灵敏度,并以细粒棘球蚴组织DNA为模板测定3种方法的灵敏度.结果 半巢式PCR法灵敏度高,59份样本全部扩增出561 bp条带,但需要测序才能确定虫种;多重PCR法能扩增出3份巨颈绦虫囊尾蚴(带绦虫)样本(3/3,100%),5份(5/8,62.5%)细粒棘球蚴样本,23份(23/48,47.9%)多房棘球蚴样本,其余28份样本为假阴性;PCR-RFLP扩增细粒棘球蚴、多房棘球蚴和巨颈绦虫囊尾蚴(带科绦虫)的阳性率与多重PCR相同,且PCR-RFLP不能区分细粒棘球绦虫G1型和带科绦虫.统计学分析显示半巢式PCR法的棘球蚴检出率高于PCR-RFLP法和多重PCR法.半巢式PCR法灵敏度分别是PCR-RFLP法和多重PCR法的1 000倍和100倍,低检出细粒棘球蚴DNA浓度为253 pg/lμ.结论 根据不同研究目的,可组合选用多重PCR法、PCR-RFLP法、半巢式PCR法区分细粒棘球绦虫G1型、G6型,多房棘球绦虫,石渠棘球绦虫和带绦虫.
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荧光定量PCR用于按蚊体内疟原虫子孢子检测的研究
目的 建立一种用于按蚊体内疟原虫子孢子定量检测和虫种鉴别的荧光定量PCR方法.方法 采用针对4种人体疟原虫18S rRNA基因属特异性保守区的1对引物,以疟原虫18S rRNA基因重组质粒与按蚊DNA的混合物为模板,进行反应体系和反应条件优化,验证方法的特异性,并通过熔解曲线分析进行虫种鉴别.应用阴性按蚊DNA稀释的间日疟原虫18S rRNA基因重组质粒为模板制作标准曲线,并分别以质粒DNA和实验室子孢子感染阳性的按蚊DNA为模板分析建立的荧光定量PCR方法的敏感性.在反应体系中加入不同部位、不同用量按蚊DNA,以探讨按蚊DNA对检测效果的影响.结果 该方法对按蚊、人血DNA均无扩增,对4种疟原虫DNA均有特异性扩增且扩增产物的熔解温度(Tm)易于区分,三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的Tm值分别为71.0、72.7、73.9℃和75.9℃.标准曲线中循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的相关性(相关系数r=-0.99).低可以检出含50拷贝的质粒DNA或32倍稀释的子孢子阳性按蚊DNA样本.按蚊DNA对荧光定量PCR反应具有抑制作用.荧光定量PCR的Ct值在实验内和实验间均具有良好的重现性.结论 新建立的SYBR Green Ⅰ染料荧光定量PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于按蚊体内疟原虫子孢子的检测,并可同时对4种人体疟原虫进行鉴别.
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SYBRGreenⅠ染料法定量PCR用于人体疟原虫定量检测及虫种鉴别的研究
目的 建立一种可用于疟原虫检测并同时鉴别虫种的荧光定量PCR方法.方法 根据人体疟原虫18SrRNA基因序列特征,在疟原虫种特异性区域两侧的属特异性保守区设计引物,对4种人体疟原虫进行PCR扩增,将得到的扩增产物采用TA克隆法插入pGEM-T载体制备标准质粒,用于制备标准曲线进行定量分析,并进行熔解曲线分析,测定各虫种扩增产物的熔解温度.结果 4种人体疟原虫均能扩增得到特异性片断,荧光定量PCR方法中建立的标准曲线相关关系较好(相关系数r =-1.00),熔解曲线分析结果显示,4种人体疟原虫的熔解温度相差较大,分别为三日疟原虫71.3℃、恶性疟原虫72.8℃、卵形疟原虫74.6℃和间日疟原虫75.8℃.结论 建立的SYBR Green Ⅰ染料法荧光定量PCR技术可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别.
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蛔虫卵在加藤厚涂片法检查时形态变异的观察
[目的] 了解加藤厚涂片法的玻片内蛔虫卵各种不同形态的变化与鉴别技术.[方法] 以透明好的加藤片逐一镜检,对各种蛔虫卵的形态、大小、颜色、卵壳厚薄及卵内细胞发育情况进行描述登记.[结果] 在蛔虫流行较为严重的邵武市与漳州市芗城区,在粪便标本进行加藤法检查时,对发现各种发育期虫卵的大小、形态与颜色的变化,很快地与近似虫卵相鉴别,并做出准确判定.[结论] 在加藤法中,各种蠕虫卵均存在形态、大小、颜色的变化,特别是蛔虫卵变异较大,应在镜检时加以注意区别.
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广西融水县并殖吸虫虫种的分子鉴别
用分子生物学方法鉴定广西融水县大小两种并殖吸虫囊蚴感染动物后所获成虫的虫种.在广西融水县采集溪蟹分离获得大小两种囊蚴,感染大鼠后获成虫,曾从形态上鉴定为斯氏狸殖吸虫和巨睾并殖吸虫.但用酚-氯仿法抽提成虫基因组DNA,PCR扩增第二内转录间隔区(ITS2)基因后测序,用Blast程序与GenBank中的斯氏狸殖吸虫、巨睾并殖吸虫等的ITS2基因序列进行同源性检索,用Primer Premier 软件比较其基因差异,用Phylip软件的Neighbor程序绘制其基因进化树后,测得大小囊蚴感染所获成虫的ITS2基因片段分别为437 bp、433 bp,两者的基因同源性为100%,与斯氏狸殖吸虫的基因同源性分别为100% 、99%,与巨睾并殖吸虫的基因同源性分别为91% 、92%;基因序列差异比较,大小囊蚴感染所获成虫与斯氏狸殖吸虫的基因序列差异为0,而与巨睾并殖吸虫存在明显差异;绘制基因进化树,大小囊蚴感染所获成虫与斯氏狸殖吸虫在同一分支同一位置,与巨睾并殖吸虫亲缘关系较远.融水县大小囊蚴感染所获成虫与斯氏狸殖吸虫为同一物种,小囊蚴感染所获成虫并非巨睾并殖吸虫.
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信息交流平台在寄生虫病辅助诊断或虫种鉴别中的应用
目的 总结"中国寄生虫学"腾讯交流平台进行寄生虫病辅助诊断或虫种鉴别的经验.方法 收集整理在信息交流平台上讨论的可疑寄生虫病或虫种的信息,梳理交流记录并进行统计分析.结果 内容涉及寄生虫病辅助诊断或虫种鉴别的时间占总交流时间19.1%,交流信息量占总记录30.2%;交流内容涉及生物种类至少39个动物种类、3个微生物种类,还有植物或花粉等;交流内容至少涉及11类人体的检材样品.结论 寄生虫病的诊断或鉴别诊断问题不容忽视,寄生虫学知识缺乏和检验样品取材不规范可致医疗人员误诊误治,网络交流平台有助于寄生虫病的辅助诊断或寄生虫的虫种鉴别.
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非洲赤道几内亚比奥科岛疟原虫感染的检测方法比较
目的:比较非洲赤道几内亚比奥科岛疟原虫检测方法的差异.方法:2010年6月至2012年7月,赤道几内亚比奥科岛马拉博医院就诊的220例疟疾患者纳入研究.应用荧光定量PCR、快速免疫法和镜检法进行检测.结果:PCR法检出率显著高于镜检法(P<0.05).三种检测方法在虫种鉴别方面无显著统计学差异(P>0.05).结论:荧光定量PCR法可用于疟原虫感染的检测.荧光定量PCR法检出率优于镜检法.
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非洲赤道几内亚儿童疟疾感染实验室检测及临床诊治分析
目的 评价荧光定量PCR法和显微镜镜检法在疟疾临床检测及虫种鉴定中的应用,了解不同型别儿童疟疾病例的临床特征,指导疟疾高发地区门诊对疟疾的早期识别、快速诊断和尽早治疗.方法 收集在几内亚首都马拉博医院儿科就诊的150例疑似疟疾患儿的末梢血样,应用荧光定量PCR和镜检法对样品进行同步检测,对两种检测方法进行分析评价,并根据不同型别疟疾病例的临床资料,分析不同型别疟疾病例的临床特征.结果 荧光定量PCR法检出阳性率为84.00％,镜检法检出率为74.67％,差异有统计学意义(P＜0.05);且PCR法在疟原虫密度大于(1～5)×102copy/mL时,可对感染的疟原虫虫种做准确的鉴定,鉴别出恶性疟、三日疟、卯形疟、间日疟的例数分别为93、19、12、2,与镜检法的82、17、11、2例比较,在恶性疟虫种鉴别上差异有统计学意义(P＜0.05),但在其他虫种鉴别中差异无明显差异(P＞0.05).该地区儿童疟疾病例以恶性疟原虫感染为主,临床主要表现为发热、贫血、咳嗽、呕吐、腹泻、抽搐等,死亡10例,其中恶性性疟9例.结论 在疟疾感染检测和疟原虫型别鉴定中,荧光定量PCR法较传统的镜检法在灵敏度及特异性方面更具优势,对马拉博地区疟疾病例的快速诊断及早期治疗具有重大意义.
