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广州管圆线虫蛋白酶体α5基因的克隆、表达及重组蛋白对人THP-1巨噬细胞凋亡的影响
目的 获得广州管圆线虫蛋白酶体α5基因(pas-5),构建其重组质粒,探讨PAS-5重组蛋白对人THP-1巨噬细胞凋亡的影响. 方法 以广州管圆线虫逆转录DNA为模板,PCR扩增pas-5基因,构建pcoldⅢ-pas-5重组质粒,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定.阳性质粒经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况,采用镍离子亲和层析法纯化重组蛋白.将用佛波酯诱导的人THP-1巨噬细胞经PAS-5(实验组)孵育18h后,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,采用ELISA检测细胞培养上清中细胞因子白细胞介素-10(IL-10)水平,另设阴性对照组(牛血清白蛋白)和空白对照组(RPMI 1640).结果 Pas-5基因PCR扩增产物约为800 bp,与预期大小相符.经菌液PCR、双酶切和测序鉴定获得pcoldⅢ-pas-5重组质粒.SDS-PAGE分析结果显示,PAS-5重组蛋白主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约28 000.Western blotting分析结果显示,重组蛋白能与兔抗鼠His单克隆抗体特异性结合.镍离子亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带.流式细胞术分析结果显示,阴性对照组和实验组人THP-1巨噬细胞凋亡率分别为(0.380±0.194)％和(0.052±0.036)％,两者差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测结果显示,实验组细胞培养上清中IL-10水平为(77.606±1.766) pg/ml,高于阴性对照组的(45.652±5.975) pg/ml (P＜0.05). 结论 获得了pas-5基因和重组质粒pcoldⅢ-pas-5,重组蛋白PAS-5可抑制人THP-1巨噬细胞凋亡,与IL-10水平提高有一定关系.
关键词： 广州管圆线虫 蛋白酶体 重组蛋白 人THP-1巨噬细胞 凋亡 -
绞股蓝总皂苷调节THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇平衡的作用机制
[目的]通过体外实验研究绞股蓝总皂苷调节THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醉平衡的作用机制.[方法]采用体外培养人THP-1巨噬细胞,以氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导THP-1巨噬细胞泡沫化为模型,用绞股蓝总皂苷进行干预.通过油红O染色观察细胞内脂质堆积情况和酶比色法定量检测细胞内总胆固醉(TC)和胆固醉酯(CE)的变化,并利用RT-PCR方法检测CD36、ABCA1、LXR-α、PPAR-α受体mRNA表达.[结果]与ox-LDL诱导组相比,绞股蓝总皂苷组(GPS组)巨噬细胞的油红O染色阳性细胞数和细胞内脂质含量均显著减少,同时CD36受体mRNA表达明显降低,而ABCA1、LXR-α、PPAR-α受体mRNA表达明显升高.[结论]绞股蓝总皂苷可抑制.ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞泡沫化,降低细胞内脂质积累,促进细胞内的脂质向细胞外转运,有利于防止泡沫细胞的形成及动脉粥样硬化的进程.该作用可能与绞股蓝总皂苷下调巨噬细胞CD36受体表达,上调巨噬细胞ABCA1、LXR-α、PPAR-α受体表达从而减弱巨噬细胞对ox-LDL的摄取和促进脂质的外排有关.
关键词： 绞股蓝总皂苷 ox-LDL 人THP-1巨噬细胞 CD36 ABCA1 -
前列腺素E2通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A信号通路上调人THP-1巨噬细胞血管内皮生成因子表达并促进体外血管生成
目的 探讨前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是否上调人THP-1巨噬细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达及其促进体外血管生成的分子机制.方法 用不同浓度PGE2、2种PGE2受体(EP2和EP4)拮抗剂或环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)通路特异性抑制剂SQ22536、H89处理人THP-1巨噬细胞,Western blotting检测人THP-1巨噬细胞内VEGF蛋白表达的变化,Transwell小室和Matrigel胶实验分析PGE2对人THP-1巨噬细胞促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)迁移和成管的影响.结果 PGE2通过EP2受体激活cAMP-PKA通路,上调人THP-1巨噬细胞VEGF蛋白表达,以及促进HUVECs的迁移和成管效应.结论 PGE2可能通过上调人THP-1源巨噬细胞VEGF的表达,并且促进血管生成,对胚胎着床起保护作用.
