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日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究
目的 探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力. 方法 利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(SjCTRL)基因(GenBank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系.采用整体原位杂交法定位SjCTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位.利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的SjCTRL基因转录水平.制备SjCTRL-dsRNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化.设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至pET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)后进行原核表达.将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验.同时设对照组.感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率. 结果 原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道.SjCTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度.SjCTRL-dsRNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7％ (P＜0.05),但未有可观察到的形态学变化.构建了pET-28a/ SjCTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白.免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4％,减卯率为80.5％. 结论 初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低SjCTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数.
