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两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定
目的 原核表达尘螨1类变应原(粉尘螨1类变应原Derfl和户尘螨1类变应原Derpl基因)的嵌合基因R8,并检测其生物活性. 方法 以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板,用Derfl的特异性引物进行PCR扩增,产物经酶切后与载体pET28a(+)连接,连接产物转入大肠埃希菌(E.coli) BL21感受态细胞,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测；纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清(IgE)的结合能力,同时以重组rDerf 1和rDerp 1蛋白作为对照.为检验嵌合蛋白R8的免疫原性,将75只BALB/c小鼠随机均分为5组,分别为PBS组(阴性对照组)、rDerf1组、rDerp 1组、R8组和哮喘组(阳性对照组).除PBS组外,其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射(0.1μ/μl)粉尘螨注射液100μl,第21～27天每鼠每天雾化吸入0.5μg/ml粉尘螨注射液悬浊液,30 min/d.rDerf1组、rDerp 1组和R8组于第25～27天雾化前30 min,分别腹腔注射100μg/ml的rDerf1、rDerp 1和R8蛋白各200 μl进行特异性免疫治疗,PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸入.所有小鼠于第27天雾化吸入后24 h气管切开,用1 ml PBS进行肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液(BALF),检测γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的水平. 结果 SDS-PAGE结果显示,R8表达产物的蛋白相对分子质量(Mr)约为35000.ELISA检测结果显示,嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为(37.03±12.46) μg/ml,显著低于rDerf1[ (80.44±15.50) μg/ml]和rDerp 1[(90.79±10.38) μg/ml](P＜0.01).动物实验结果显示,R8组IFN-γ水平[(343.43±38.79) pg/ml]与rDerf1组[(322.98±30.36) pg/ml]和rDer p 1组[(314.97±33.89) pg/ml]的相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)；与PBS组[(393.93±50.68) pg/ml]和哮喘组[(208.44±46.11) pg/ml]相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).R8组IL-4水平显著低于其他各组水平(P＜0.05或0.01). 结论 表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8.
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经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原T细胞表位融合肽疫苗载体的构建与表达
目的：构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、IhC和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列，用特异性引物PCR扩增相应的基因片段，分别用相应的双酶切后，用T4 DNA连接酶连接形成TAT-IhC-Der p 1-3T融合基因，并插入至原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组原核表达载体pET-28a(+)-TAT-IhC-Der p 1-3T，Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株，IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证，纯化TAT-IhC-Der p 1-3T蛋白后进行IgE结合试验。结果双酶切和测序结果表明，成功构建了pET-28a-TAT-IhC-Der p 1-3T重组原核表达载体；SDS-PAGE电泳分析显示TAT-IhC-Der p 1-3T可诱导表达；Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功；IgE结合试验表明TAT-IhC-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清IgE的能力强于Der p 1变应原（P<0.001）。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组pET-28a-TAT-IhC-Der p 1-3T载体，纯化的TAT-IhC-Der p 1-3T具有较强的IgE结合能力，从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。
