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细针穿刺标本及外周循环中miR-191和miR-494对甲状腺癌的早期诊断价值
目的 探讨良恶性甲状腺结节中死亡相关蛋白激酶(DAPK)相关miR-191和磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)相关miR-494在细针穿刺细胞学检查(FNAB)标本、外周循环中的表达水平及差异,为良恶性甲状腺结节疾病的鉴别提供分子诊断依据.方法 收集113例甲状腺结节(恶性及可疑恶性甲状腺结节48例、结节性甲状腺肿38例、甲状腺腺瘤27例)患者的FNAB标本及外周静脉血,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测其中98例甲状腺结节患者FNAB标本及外周循环中miR-191和miR-494的表达水平.通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析miR-191和miR-494,诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度.结果 (1)FNAB诊断结果与手术病理结果诊断的符合率为91.35％,FNAB诊断甲状腺癌的灵敏度为91.7％(44/48),特异度为90.9％(30/33).(2)FNAB标本及外周循环中,甲状腺癌组miR-191的表达水平明显低于良性组,而甲状腺癌组miR-494表达水平明显高于良性组(P<0.05).(3)FNAB标本及外周循环中,miR-191和miR-494对恶性甲状腺结节的诊断灵敏度与特异度均尚可(ROC曲线下面积>0.7).miR-191在FNAB标本和外周循环的灵敏度、特异度分别为76.9％、73.5％和61.5％、64.1％;miR-494分别为63.6％、76.5％和72.7％、84.6％.(4)在FNAB标本及外周循环中,甲状腺癌中miR-191和miR-494的相对表达量与年龄、性别、结节大小、有无钙化、有无颈部淋巴结肿大、甲状腺功能及甲状腺抗体有无异常这些临床基本特征之间的差异没有统计学意义(P>0.05).结论 miR-191和miR-494可作为辅助FNAB早期诊断甲状腺癌的分子标记物.
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miR-494与肿瘤研究进展
microRNAs(简称miRNAs)是一种由22个核苷酸组成的内源性非编码小分子单链RNA,成熟的miRNA与靶基因互补序列相结合来调控基因的表达,从而参与细胞的增殖、分化和凋亡.miR-494作为miRNAs家族中的一员,在肝癌、肺癌、胃肠道肿瘤、脑部肿瘤等疾病中呈现不同的差异表达,其通过发挥抑癌基因或癌基因样作用影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程,从而影响肿瘤的发生发展.全文就miR-494与肿瘤关系的研究进展进行综述.
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CLPTM1L与miR-494靶向关系的双荧光素酶报告实验验证
目的:确定miR-494与CLPTM1L的靶向关系.方法:采用生物信息学方法预测miR-494与CLPTM1L基因的结合位点.采用PCR技术扩增CLPTM1L基因3'UTR片段,并克隆至pmirGLO载体,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒.将培养的293T细胞分为4组,分别共转染miR-494或阴性对照和pmirGLO-CLPTM1L-W 3'UTR或pmirGLO-CLPTM1L-M 3'UTR,检测4组细胞中荧光素酶活性.结果:酶切和测序证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒pmirGLO-CLPTM1 L-W 3'UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3'UTR;与共转染miR-494 mimics和突变型CLPTM1L3'UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(1.056 4±0.163 4)、共转染阴性对照序列和突变质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.961 3±0.177 9)或野生型质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.983 4±0.001 2)相比,共转染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3'UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明显降低(F =4.476,P=0.040),其他3组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:CLPTM1L与miR-494存在靶向关系.
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miR-494下调Sox9的表达对骨肉瘤细胞MG-63增殖和侵袭的影响
目的 探讨miR-494对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与侵袭的影响,并验证Sox9是否为miR-494的靶基因.方法 过表达miR-494后,利用CCK-8、克隆形成实验检测MG-63细胞的增殖,利用Transwell实验检测细胞的侵袭能力.Western blot与荧光定量PCR检测Sox9蛋白与mRNA水平的表达.结果 MG-63细胞转染腺病毒miR-494后,miR-494表达明显升高(t=36.78,P=0.000),Ad-miR-494转染组MG-63细胞增殖(F=1.711,P=0.012)、克隆形成(F=2.742,P=0.019)和侵袭能力(F=1.653,P=0.006)较Ad-GFP组下降.过表达miR-494后,Sox9蛋白(F=5.827,P=0.021)和mRNA表达水平(F=5.827,P=0.021)下降.而Sox9的下调使MG-63细胞增殖(t=27.54,P=0.042)、克隆形成(t=29.64,P=0.026)和侵袭能力(t=32.48,P=0.016)下降.结论 miR-494通过Sox9抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖与侵袭.
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miR-494通过抑制SIRT1表达调节人宫颈癌Hela细胞系增殖和迁移
目的 观察宫颈癌组织中miR-494的表达情况及其对宫颈癌细胞系Hela增殖和迁移的影响,并对其相关机制进行初步的分析. 方法 RT-PCR方法检测miR-494在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达情况.克隆形成实验检测miR-494对宫颈癌细胞系Hela增殖能力的影响;划痕实验检测miR-494对宫颈癌细胞系Hela迁移能力的影响.TargetScans软件预测miR-494可能的靶基因,并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的靶基因.Western blot方法检测miR-494对预测靶基因表达的影响. 结果 miR-494在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达较正常组织相比显著降低(P＜0.01).转染miR-494可显著抑制Hela细胞的增殖和迁移能力(P＜0.01),而转染anti-miR-494可增加Hela细胞的增殖和迁移能力(P＜0.01).Targetsscan软件预测miR-494可能的靶基因为去乙酰化酶1(sirtuin 1,SIRT1),且得到荧光素报告实验结果证实.Western blot结果显示转染miR-494可显著抑制Hela细胞中SIRT1的表达(P＜0.01),而转染anti-miR-494可增加Hela细胞中SIRT1的表达(P＜0.01). 结论 miR-494可通过调节SIRT1的表达而发挥宫颈癌抑制作用.
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外周血miR-494及Let-7e在诊断急性缺血性脑卒中患者中的临床价值
目的：通过检测急性缺血性脑卒中患者与正常对照组外周血中miR-494及Let-7e的表达水平，探讨其与急性缺血性脑卒中的关系。方法：收集67例急性缺血性脑卒中患者及50例非卒中正常健康人群，采用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR)检测血浆中miR-494及Let-7e表达水平，比较两组外周血中表达水平的差异。并对miR-494及Let-7e行ROC曲线分析，分析其对急性缺血性脑卒中的诊断价值。进一步将急性缺血性脑卒中患者分为预后不佳组(MRS 3-6)和预后良好组(MRS0-2)，分析其在两组之间的差异。结果：急性缺血性脑卒中患者外周血中的miR-494(1.71±1.14)及Let-7e(1.43±0.93)的表达水平较正常对照组外周血明显升高(P<0.05)。miR-494及Let-7eROC曲线下面积分别为0.777、0.756。预后不良组的miR-494(2.04±0.11 vs.1.46±0.05)及Let-7e(1.68±0.61 vs.1.24±0.27)表达水平均较预后良好组显著升高，两组之间有统计学差异(P<0.05)。结论：miR-494及Let-7e可能与急性缺血性脑卒中相关，对急性缺血性脑卒中患者的临床诊断和预后判断具有潜在的应用价值。
关键词： 缺血性脑卒中 miR-494 let-7e 实时荧光定量PCR法 MRS评分 -
miR-494对肺癌细胞株A549及SPCA1生长及侵袭的抑制作用
目的 探讨miR-494对肺癌细胞增殖、侵袭的影响及分子机制.方法 利用化学合成的miR-494mimics转染A549及SPCA1肺癌细胞株,通过MTT、Transwell小室迁移实验、Boyden小室侵袭实验等观察过表达miR-494后细胞迁移、侵袭能力及生长的变化；利用Western blot检测细胞周期、上皮间叶转变(EMT)标志物相关蛋白.结果 MTT法显示,与对照组比较,过表达miR-494组细胞生长速度减慢,差异有统计学意义(P＜0.001).Transwell及Boyden实验显示过表达组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量少于对照组,差异有统计学意义(P ＜0.001).Western blot结果显示,与对照组比较,过表达miR-494的A549和SPCA1细胞中,CCND1、N-CA、VIMENTIN表达下调.结论 miR-494可能通过下调CCND1、VIMENTIN、N-CA对肺癌细胞株A549及SPCA1的增殖、迁移及侵袭起到抑制作用.
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骨肉瘤组织中miR-494、miR-130b下游靶基因的探究
目的 :研究骨肉瘤组织中miR-494、miR-130b的表达量并探究下游靶基因.方法 :收集在延安大学附属医院手术切除的骨肉瘤组织,另取同期关节置换术后的正常骨组织作为对照;抽提miRNA后测定miR-494、miR-130b的表达量,抽提RNA后测定增殖基因 、侵袭基因的mRNA表达量,抽提蛋白后测定血管新生分子的蛋白含量.结果 :骨肉瘤组织中miR-494、Runx3、ELL2、p16、RECK、TIMP1的表达量以及TSSC3的蛋白含量显著低于正常骨组织,miR-130b、β-catenin、CyclinD1、Sox9、AD-AM TS18、CatD、STMN1的表达量以及CEACAM6、VEGF、Ang-2的蛋白含量显著高于正常骨组织;骨肉瘤组织中miR-494与Runx3、ELL2、p16、RECK、TIMP1、TSSC3呈正相关,与 β-catenin、Cy-clinD1、Sox9、ADAM TS18、CatD、STM N1、CEACAM6、VEGF、Ang-2呈负相关,miR-130b与Runx3、ELL2、p16、RECK、TIMP1、TSSC3呈负相关,与 β-catenin、CyclinD1、Sox9、ADAM TS18、CatD、ST-MN1、CEACAM6、VEGF、Ang-2呈正相关.结论 :骨肉瘤组织中miR-494的低表达以及miR-130b的高表达能够调控增殖 、侵袭基因的表达及血管新生分子的生成.
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miR-494慢病毒表达载体的构建
目的:构建miR-494基因的慢病毒表达载体.方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增hsa-miR -494基因,用Xho Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切携带EGFP的慢病毒载体pGIPZ,酶切产物电泳后回收约11kb的载体片段.使用DNA连接试剂盒中的Solution Ⅰ将其与miR-494连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR-494测序,所构建载体命名为pGIPZ-miR-494-eGFP,获pGIPZ-miR-494-eGFP后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产.将慢病毒颗粒以适滴度感染人体肺腺癌细胞株A549,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用Real-Time PCR检测感染效率.结果:目的基因与慢病毒载体连接成功.共转染293T细胞包装病毒与浓缩后滴度达1.02×108TU/ml,并转染到肺腺癌细胞株A549上,Aldefluor流式分选出的细胞后通过Real-Time PCR检测结果显示miR-494慢病毒表达载体感染的A549细胞miR-494表达高于对照组达10倍以上.结论:成功构建携带人miR-494基因的慢病毒表达载体pGIPZ-miR-494-eGFP,为相关后续研究打下了良好基础.
