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4种人肾细胞癌原位移植裸鼠模型建立方法的比较
背景与目的:肾细胞癌是常见的肾脏恶性肿瘤,起病隐匿,恶性程度高.研究旨在建立成功率高、稳定的人肾细胞癌原位动物造模方法.方法:采用人肾细胞癌细胞(786-0、ACHN)进行细胞悬液原位注射法、皮下成瘤后引瘤原代细胞悬液原位注射法、皮下成瘤后引瘤组织块原位移植肾包膜下法及皮下成瘤后引瘤组织块原位移植肾周筋膜内法建立原位移植裸鼠模型,采用PET/CT、H-E染色、免疫组织化学染色及血清生化检测等手段观察成瘤率及肿瘤生长情况,评估4种方法的建模效果.结果:人肾细胞癌皮下移植瘤裸鼠模型,ACHN组成瘤率(90%)高于786-0组(30%);人肾细胞癌原位移植裸鼠模型,786-0原位注射组、ACHN原位注射组、ACHN皮下移植瘤引瘤后原代细胞原位注射组、ACHN组织块肾包膜下包埋组和ACHN组织块肾周筋膜内包埋组的成瘤率分别为33%、80%、90%、100%和20%,其中以ACHN皮下成瘤后引瘤组织块原位移植肾包膜下法成瘤率高,影像学及病理组织学检查结果显示符合低分化肾细胞癌.结论:成功建立4种人肾细胞癌原位移植裸鼠模型,其中以ACHN皮下成瘤后引瘤组织块原位移植肾包膜下法成瘤效果佳,为肾细胞癌发病机制及靶向治疗的进一步研究提供理想的动物模型.
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人肾癌中HSP70的量子点标记检测及意义
目的:探讨量子点荧光技术检测人肾癌中HSP70的表达及意义.方法:利用量子点的荧光特性,间接免疫荧光和细胞免疫化学法检测人肾癌组织及体外培养的人肾癌ACHN细胞中量子点特异性标记的HSP70的表达情况.探明量子点荧光技术与传统标记技术比较的优越性.结果:共聚焦荧光显微镜下可见人肾癌组织及体外培养的人肾癌ACHN细胞中HSP70均有明显表达,呈现均匀分布的橙红色强荧光.较之FITC标记法,量子点荧光具有特异性强、背景清晰等特点,且量子点持续激发30min后无荧光淬灭发生.结论:量子点荧光标记技术能够标记亚细胞水平蛋白质,且与传统的标记方法相比具有显著优点,可作为一种新的技术应用于各种标记检测方法中.
关键词： 肾肿瘤 量子点 HSP70热休克蛋白质类 ACHN细胞 -
人ACHN肾癌裸鼠荷瘤模型建立及相关特性研究
[目的]探讨建立肾癌ACHN细胞系裸鼠皮下移植瘤及转移瘤模型的适宜条件.[方法] MTT法观察细胞生长情况.将裸鼠分组,分别用2.0×106/100μlA组)、3.0×106/100μl(B组)和4.0×106/100μl(C组)的细胞接种浓度,注入裸鼠后项中间皮下;用4.0×106/100μl的细胞接种浓度,分别接种于裸鼠后项中间(C组)、背部(D组)和前肢腋窝皮下(E组);分别用第20代(F组),第30代(G组)和第10代(C组)的肿瘤细胞4.0×106/100μl,注入裸鼠后项中间,观察各组成瘤情况.尾静脉注射瘤细胞1.0×106/ml建立转移模型.[结果] 第4天细胞进入对数生长期.A组成瘤率为33.3%、B组和C组的成瘤率均为100%,但C组的成瘤速度明显高于B组;C组、D组和E组的成瘤率均为100%,注射肿瘤细胞后第10天,C组、D组和E组的肿瘤生长平均相对体积,各组间尚无明显差异;注射后第30天,C组的肿瘤生长平均相对体积显著高于D组和E组(P<0.05);G组的成瘤率为83.3%,F组的成瘤率为100%,与C组相比,无显著性差异(P>0.05).尾静脉注射组全部出现转移灶.[结论]使用ACHN细胞株,控制好浓度、接种部位以及传代次数后能获得较理想的裸鼠肾癌皮下移植瘤模型;使用传统尾静脉注射法可以建立裸鼠转移模型.
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LRRK2在肾癌细胞中的表达及其对迁移能力的影响
目的 探讨LRRK2蛋白在人肾癌细胞ACHN中的表达及其对迁移能力的影响.方法 Western blot检测人肾小管上皮细胞(HK2)与人肾癌细胞ACHN中LRRK2蛋白的表达,小室体外迁移实验检测HK2与ACHN细胞迁移能力;体外培养ACHN细胞,分别转染pcDNA-LRRK2及LRRK2-siRNA 24 h,收获细胞Western blot检测LRRK2蛋白的表达,小室体外迁移实验检测ACHN细胞迁移能力的改变.结果 ACHN细胞LRRK2蛋白表达量及迁移能力显著高于HK2细胞(P<0.05);质粒转染方法 能有效介导ACHN细胞LRRK2蛋白表达上调(P<0.05),LRRK2蛋白表达上调可以使ACHN细胞迁移能力增强(P<0.05);脂质体转染方法 能够有效介导ACHN细胞LRRK2蛋白表达下调(P<0.05),LRRK2蛋白表达下调能够显著抑制ACHN细胞迁移能力(P<0.05).结论 LRRK2蛋白表达水平可能与人肾癌细胞ACHN恶性程度及侵袭转移特性有关.
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肾癌ACHN细胞exosome对自身细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨肾癌ACHN细胞来源的exosome对肾癌ACHN细胞自身增殖和凋亡的影响及机制.方法 用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome；采用CCK-8法评价exosome对肾癌ACHN细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化；RT-PCR和Western blotting检测CyclinD1、caspase-3 mRNA和蛋白的表达；Western blotting检测p-Akt、p-ERK1/2的变化.结果 成功使用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome.exosome可促进肾癌ACHN细胞增殖,抑制其凋亡；在此过程中,CyclinD1 mRNA和蛋白的表达均上调,而caspase-3 mRNA表达无明显变化,caspase-3蛋白表达下调；同时p-Akt和p-ERK 1/2的表达也上调.结论 exosome 可促进肾癌ACHN细胞生长和增殖,抑制细胞凋亡.筛除肾癌微环境中的exosome或抑制其功能,可能成为肾癌治疗的有效新方法.
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肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选
目的 采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因有干扰沉默作用的真核表达质粒.方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA(siRNA)序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24 h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR(real time-PCR)和免疫印记杂交法(Western blot)分别检测HIF-1α的 mRNA与蛋白表达水平.结果 质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降(P<0.05),质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果佳.结论 本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段.
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姜黄素对人肾癌ACHN细胞放射的增敏作用及其机制
目的 研究姜黄素对人肾癌ACHN细胞放射的增敏作用,并探讨其作用机制.方法 以人肾癌ACHN细胞为研究对象,MTT比色法检测姜黄素对人肾癌ACHN细胞增殖的抑制作用;克隆形成实验检测姜黄素对ACHN细胞的放射增敏作用;流式细胞术检测ACHN细胞周期分布;RT-PCR检测ACHN细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65和DNA-PKcs mRNA的表达.结果 姜黄素对人肾癌ACHN细胞生长具有明显的抑制作用,且呈现剂量和时间效应.10μmol/L姜黄素可降低放射后人肾癌ACHN细胞的细胞存活分数(P＜0.05),有放射增敏作用,放射增敏比SERDq为2.36.药物+放射组ACHN细胞周期阻滞在放射敏感时相G2/M期.与放射组相比,药物+放射组Bcl-2、NF-κB P65和DNA-PKcs mRNA水平明显降低(P＜0.05).结论 姜黄素对人肾癌ACHN细胞具有放射增敏作用,其作用机制可能与其抑制ACHN细胞NF-κB表达,下调Bcl-2/Bax比例,抑制DNA损伤修复,改变ACHN细胞周期分布有关.
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干扰素α-1b联合环氧化酶-2抑制剂对肾癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用
目的：探讨干扰素α-1b（interferonα-1b，IFNα-1b）联合环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂对人肾癌ACHN细胞及其裸鼠肾癌移植瘤生长的抑制作用及其相关机制。方法 ACHN细胞及裸鼠根据用药不同分为IFNα-1b组、NS398组（ COX-2抑制剂）、联合用药组及空白对照组。 CCK8检测用药24 h和48 h后各组细胞增殖抑制率；Western blot检测用药前后各组细胞bcl-xl、COX-2蛋白表达变化。测量并记录各组裸鼠移植瘤的大小，免疫组化方法检测裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达。结果2种药物对ACHN细胞均有抑制作用，且呈剂量依赖性，联合用药优于单用（ P＜0．05）；IFNα-1b和NS398均能促进肿瘤细胞凋亡，联合用药促凋亡效果优于单用（P＜0．05）；Western blot结果显示用药各组的bcl-xl、COX-2蛋白表达与对照组相比均下调，联合用药的抑制效果优于单用（ P＜0．05）。免疫组化显示用药各组的裸鼠移植瘤中 VEGF 均受抑制，联合组抑制作用明显（P＜0．05）。结论 IFNα-1b联合COX-2抑制剂对ACHN细胞增殖及其移植瘤生长具有一定的抑制作用。
