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沉默结缔组织生长因子基因重组腺病毒的构建及功能验证
目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证.方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠埃希菌BJ5183,构建重组腺病毒载体Ad-siCTGF;腺病毒载体用Pac I酶切线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒;采用"乒乓交互感染法"提高病毒滴度.用此病毒感染4T1细胞,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)及Western 印迹法验证其沉默效果.结果:Pac I酶切电泳证实重组腺病毒载体Ad-siCTGF构建成功,扩增纯化后测定重组病毒Ad-siCTGF的滴度为2.6×10~(10) pfu/mL.感染此病毒后,4T1细胞中CTGF mRNA表达水平下调至36.27%,蛋白表达水平下调至31.56%.结论:成功构建能沉默CTGF基因的重组腺病毒,为进一步研究CTGF在肿瘤中的作用机制奠定了基础.
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2-甲氧基雌二醇对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的生长抑制作用
目的:探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对多种肿瘤细胞的生长抑制作用.方法:以鼠乳癌4T1细胞株、人肺腺癌SPC-A1细胞株、人前列腺癌PC-3细胞株为研究对象,采用SRB法考察2-ME对多种肿瘤细胞的生长抑制作用,并联合维拉帕米,利用协同指数探讨影响2-ME抗癌作用的因素.结果:2-ME对4T1、SPC-A1和PC-3细胞有不同程度的抑制作用,IC50分别是6.11、1.89和5.12 μmol/L;联合维拉帕米后,抑制率高于单独用药组(P<0.01,IC50分别降低至2.01、0.57和2.77 μmol/L,协同指数0.77～0.43.结论:2-ME对3种细胞都有一定的生长抑制作用,维拉帕米对2-ME有明显的增效作用.
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阿魏药酒抗肿瘤作用的初步探讨
目的 通过整体、细胞、分子三个水平实验,初步研究阿魏药酒的抗肿瘤作用.方法 建立小鼠H22肝癌皮下移植模型,灌胃阿魏药酒后测定肿瘤体积、体质量、免疫器官指数和血清中Col-I、CAT、T-SOD活力;采用MTT法测定不同浓度阿魏药酒对小鼠脾淋巴细胞增殖和肿瘤细胞生长的影响;明胶基质金属酶谱法考察阿魏药酒对基质金属蛋白酶表达的影响.结果 本实验剂量下,与对照组比较,阿魏药酒灌胃可使肿瘤生长减慢,抑瘤率为12.8%,对各脏器指数均无显著性影响,可使血清中Col-I、T-SOD和CAT活力增强,给药期间不影响小鼠生长状态;实验所用阿魏药酒浓度对小鼠乳腺癌4T1细胞生长无明显影响,低浓度能促进小鼠脾淋巴细胞增殖;阿魏药酒可降低MMP-2和MMP-9的表达.结论 阿魏药酒对肿瘤细胞无直接生长抑制作用,可阻止肿瘤的浸润和转移,与具有细胞毒作用的其他中药联合用于抗肿瘤治疗更合理,其抗肿瘤作用可能与其免疫调节和抗氧化作用有关.
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P1/Fas-CCL19双表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定
目的 利用pAdEasy-1腺病毒包装系统构建血型B抗原模拟多肽P1/Fas CCL19双表达重组腺病毒,并在体内外试验中验证其表达及可能的疗效.方法 应用腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdEasy-1构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-P1/Fas-CCＬ19并转染至HEK293A细胞,获得重组腺病毒Ad-P1/Fas-CCL19颗粒后进一步感染乳腺癌4T1细胞并鉴定转染4T1细胞内P1/Fas-CCL19mRNA和蛋白质的表达.构建经人B型血红细胞免疫的4T1荷瘤小鼠模型,比较瘤内注射重组腺病毒Ad-P1/Fas-CCL19组、空腺病毒组、0.9％氯化钠溶液组的荷瘤小鼠的肿瘤变化及生存期.结果 感染后4T1细胞中P1/Fas-CCL19 mRNA和蛋白质均有表达.瘤内注射重组腺病毒Ad-P1/Fas-CCL19较瘤内注射空腺病毒、0.9％氯化钠溶液明显抑制4T1肿瘤的生长,但三组小鼠的生存期无明显区别.结论 P1/Fas-CCL19重组腺病毒载体成功构建,体内外实验均证明了其稳定表达及有效性,为进一步临床研究奠定了基础.
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针药联合对荷瘤小鼠HSP70及局部免疫的影响
目的:探究瘤周围刺联合环磷酰胺(CTX)对4T1乳腺荷瘤小鼠HSP70及局部免疫的影响.方法:将造模成功的4T1乳腺荷瘤小鼠随机分为模型组、药物组、针刺组、针药组,其中模型组不干预;药物组隔天腹腔注射 CTX(50 mg/kg);针刺组予瘤周围刺(1次/d);针药组予腹腔注射CTX配合瘤周围刺.实验干预2周后测瘤质量计算抑瘤率,免疫组化(IHC)染色热休克蛋白(HSP)70后采用IPP6.0图像分析软件计算阳性表达结果,流式细胞术(FCM)检测肿瘤组织中CD4+CD25+Treg、PD-L1阳性表达情况.结果:针刺或CTX均可抑制肿瘤生长、降低HSP70表达,针刺联合CTX在抑制肿瘤生长和HSP70表达上具有协同作用.CTX可减少CD4+CD25+Treg细胞表达量、增加PD-L1阳性率,但针刺或针药联合对此无明显作用.结论:针刺联合CTX对肿瘤微环境中HSP70表达具有抑制作用,但对Treg细胞、PD-L1无明显作用.
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芪术蚤复方对乳腺癌模型小鼠的抑制作用及机制研究
目的:观察芪术蚤(QZZ)复方对乳腺癌模型小鼠的影响,并探讨其作用机制.方法:4T1乳腺癌细胞于右胸皮下注射,建立乳腺癌模型小鼠,取50只造模成功的模型小鼠随机分5组,每组10只,分别为模型对照组、阳性对照组、芪术蚤复方20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg组,阳性对照组腹腔注射顺铂(1mg/kg)、芪术蚤复方20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg组分别灌胃给予芪术蚤复方20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg,模型对照组给予等体积生理盐水,1次/日,连续给药2周.停药第二天分离瘤体、胸腺和脾脏,计算重量、抑瘤率、胸腺指数及脾指数、观察瘤体病理学结果;ELISA检测小鼠血清IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α水平,RT-PCR检测模型小鼠血清TGF-β1、TFN-γ、VEGFmRNA的表达水平,流式细胞仪检测各组腺癌模型小鼠外周血中CD4+、CD8+水平及值.结果:给药2周后与模型组相比,芪术蚤复方可显著抑制乳腺癌模型小鼠肉瘤的生长,提高胸腺指数和脾指数(P＜0.05);通过病理学观察发现芪术蚤复方给药组癌细胞排列疏松,核固缩,血管较模型对照组减少明显;芪术蚤复方给药组小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平也显著升高(P＜0.05),TGF-β1、VEGF mRNA的表达水平显著降低(P＜0.05),小鼠外周血中CD4 +/CD8+的水平显著升高(P＜0.05).结论:芪术蚤复方可抑制肿瘤细胞生长,其机制可能是通过调节乳腺肿瘤微环境中调节性T细胞的数量及比例提高乳腺癌模型鼠免疫功能,进而抑制乳腺癌模型小鼠乳腺肿瘤组织的生长.
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槐耳颗粒免疫调控CXCL1在乳腺癌中的作用研究
目的 研究CXCL1与乳腺癌增殖转移的相关性,为乳腺癌发病机制提供线索,探究中药槐耳颗粒对乳腺癌发生发展的影响及其发挥效应的机制,为乳腺癌的治疗提供理论依据.方法 分别设置1 nmol/ml CXCL1组、0.1 nmo1/ml CXCL1组、anti-CXCR2中和抗体处理组、5 mg/ml槐耳颗粒组、10 mg/ml槐耳颗粒组及空白对照组6组.CCK8检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,ELISA检测槐耳颗粒组与空白对照组CXCL1表达量,ELISA检测各组细胞Survivin、VEGF、MMP13的表达量.结果 CCK8检测细胞增殖活性:与空白对照组相比,CXCL1处理组细胞增殖活性明显增高且存在剂量依赖关系,有统计学意义(P＜0.05);与空白对照组相比,anti-CXCR2中和抗体处理组细胞增殖活性明显降低(P＜0.05);与空白对照组相比,槐耳颗粒组细胞增殖活性明显降低(P＜0.05)且存在剂量依赖关系;流式测细胞凋亡结果:与空白对照组相比,CXCL1处理组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)且存在剂量依赖关系,与空白对照组相比,anti-CXCR2中和抗体处理组细胞凋亡率明显增高(P＜0.05),与空白对照组相比,槐耳颗粒组细胞凋亡率明显增高且随浓度增加作用增强(P＜0.05);CXCL1表达量:与空白对照组相比,槐耳颗粒组CXCL1表达量明显降低(P＜0.05),且存在剂量依赖关系;survivin、VEGF、MMP13表达量:与空白对照组相比,CXCL1处理组蛋白表达量明显增高(p＜0.05)且存在剂量依赖关系,anti-CXCR2中和抗体处理组蛋白表达量明显降低(P＜0.05),槐耳颗粒组蛋白表达量明显降低(P＜0.05)且存在剂量依赖关系.结论 乳腺癌中CXCL1通过与其受体CXCR2结合促进survivin的表达从而促进乳腺癌细胞的增殖抑制其凋亡,促进乳腺癌的发生;同时通过促进VEGF与MMP13的表达促进肿瘤血管的生成及细胞外基质的降解,提示CXCL1可能促进肿瘤转移.中药槐耳颗粒可通过抑制CXCL1表达而有效抑制乳腺癌细胞的增殖以及侵袭转移从而达到治疗效果.
