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B6-Co小鼠角膜病的细菌学因素探讨
目的 探讨B6-Co小鼠角膜浑浊形成的细菌学因素.方法 以正常B6和B6-Co小鼠为研究对象,从不同日龄组的小鼠眼部取角膜分泌物或角膜刮片,分别接种到血平板和营养肉汤上,恒温培养24h.挑取菌落或肉汤管内的悬浮液涂片,革兰氏氏染色,镜检,记录结果.将纯化培养获得的细菌进行鉴定.结果 正常B6小鼠与角膜浑浊小鼠存在角膜细菌学差异.结论 B6-Co小鼠角膜混浊与微生物感染有关.
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B6-Co小鼠Ankrd55和Ddx4突变候选基因克隆及测序
目的 对B6-Co小鼠Ankrd55和Ddx4基因进行克隆测序分析,寻找是否存在突变位点.方法 以小鼠Ankrd55和Ddx4基因的mRNA序列设计引物,以mRNA为模板,采用RT-PCR和PCR技术分段进行目的基因扩增,将目的片段连接在T载体上,转化至感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒DNA分子,电泳检测,EooR(E)酶切释放目的片段,测序、分析、比对.结果 Ddx4基因位于小鼠13号染色体第113412349的碱基由C转换成A,导致编码氨基酸的密码子改变,产物脯氨酸(P)变成谷氨酰胺(Q).结论 Ddx4基因发生单碱基突变,表明该突变可能与B6-Co小鼠的EOB表型相关,但是有待于进一步研究.
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PCR法检测B6-Co小鼠混浊角膜的病原菌
目的:检测遗传性角膜病小鼠混浊角膜的病原菌及其种类.方法:取不间发育阶段的B6-Co小鼠36例(模型组)和正常B6小鼠10例(对照组)的角膜,分别提取DNA,运用聚合酶链反应(PCR)技术进行扩增,琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测.结果:36例模型组的角膜,细菌PCR检测阳性21例,阳性率为58.33%.真菌PCR检测标本36例,7例阳性,阳性率为19.44%.结论:病原菌感染是引起B6-Co小鼠角膜病变的重要原因.
关键词： 聚合酶链反应(PCR) 病原菌 B6-Co小鼠 角膜病 -
B6-Co角膜病小鼠HSV检测
目的:探讨ENU诱导遗传性角膜病小鼠角膜混浊的病毒学因素.方法:取不同发育阶段的B6-Co小鼠48只(模型组)和正常B6小鼠16只(对照组)的角膜,提取DNA,运用PCR技术进行扩增,琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行HSV检测.结果:模型组的角膜中仅2只(4.17%)检测到HSV-DNA.对照组的角膜中均未检测出HSV-DNA,模型组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:HSV与B6-Co小鼠角膜混浊不存在因果关系.
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TGFα/EGFR通路相关蛋白在B6-Co小鼠眼睑中的表达
目的 研究转化生长因子α(transforming growth factor α,TGFα)/表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)通路相关蛋白在B6-Co胎鼠眼睑中的表达情况,探讨B6-Co小鼠眼睑发育异常的原因.方法 取胚胎16.5 d、17.5 d、18.5 d的B6和B6-Co胎鼠头部,做冰冻切片,通过免疫荧光法检测各时间点TGFα在眼睑部位的原位表达情况;提取蛋白,采用Western blot法检测TGFα表达及EGFR、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化蛋白表达情况.结果 免疫荧光检测结果示,TGFα主要表达于眼睑间质区,3个时间点B6-Co胎鼠眼睑中TGFα表达的荧光强度均高于同一时间点在B6胎鼠眼睑中的表达.Western blot检测结果示,3个时间点B6-Co胎鼠眼睑中TGFα、p-EGFR的表达与B6胎鼠相比,差异均无统计学意义(均为P＞0.05).p-ERK在胚胎16.5 d和17.5 d时,B6-Co胎鼠眼睑中的表达量分别为3.79±0.32和3.77±0.16,均显著高于在相应时间点B6胎鼠眼睑中的表达量1.48±0.11和1.45±0.07,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 TGFα/EGFR通路的下游因子ERK可能是导致B6-Co小鼠眼睑异常发育的重要因子.
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应用16S rDNA克隆文库法分析B6-Co小鼠角膜炎细菌组成
目的 鉴定B6-Co突变系小鼠角膜的病原菌组成,并与人类细菌性角膜炎病原菌组成进行比较分析.方法 选取10 d龄B6小鼠和B6-Co小鼠各6只为实验动物,提取小鼠角膜组织刮取物细菌基因组DNA,通过PCR扩增构建16S rDNA克隆文库,采用随机测序法分析B6-Co小鼠角膜细菌组成,B6小鼠作为对照.结果 B6-Co角膜混浊小鼠中共鉴定出20种细菌,隶属于15个属,包括葡萄球菌属、假单胞菌属、链球菌属、微球菌属、棒状杆菌属等.葡萄球菌属和假单胞菌属为优势群,葡萄球菌属丰度为19.7％ ～53.1％,假单胞菌属的丰度为17.4％ ～ 32.8％.其中葡萄球菌属主要是表皮葡萄球菌,丰度为13.8％～20.9％;缓慢葡萄球菌,丰度为14.0％ ～30.9％;金黄色葡萄球菌,丰度为7.4％ ～ 20.3％.此外,棒状杆菌和微球菌也比较常见.10 d龄B6小鼠未检测出细菌.结论 B6-Co突变系小鼠角膜细菌组成与人类角膜炎病原菌相似,是研究人类角膜炎诊断方法、发病机理及临床用药的很好的动物模型.
关键词： 细菌性角膜炎 16S rDNA克隆文库 细菌组成 B6-Co小鼠 -
不同胚期B6-Co小鼠眼睑组织中血清反应因子的表达变化
背景 C57BL/6角膜混浊表型的突变系(B6-Co)小鼠具有出生眼睑闭合不全(EOB)表型,是研究眼睑发育机制的良好动物模型.探讨血清反应因子(SRF)与B6-Co小鼠EOB表型形成的关系可为人类先天性眼睑发育缺陷产生机制的研究提供理论依据.目的 检测SRF在B6-Co小鼠胚胎眼睑发育关键时期的表达.方法 采用肌内注射戊巴比妥钠安乐死术,分别剖取B6-Co母鼠以及表型正常B6母鼠体内胚胎期(E)16.5 d、E17.5 d和E18.5 d小鼠各9只,分离眼睑组织,分别采用实时定量PCR法和Western blot法检测小鼠眼睑组织中SRF mRNA及其蛋白的相对表达水平.取各胎龄的B6-Co小鼠和B6小鼠制作组织冰冻切片,利用免疫荧光技术检测并比较2种小鼠SRF在眼睑组织中的定位和表达强度.结果 B6-Co小鼠E16.5 d和E17.5 d眼睑组织中SRF mRNA的相对表达水平分别为0.41±0.06和0.24±0.17,明显低于B6小鼠的1.03±0.17和1.01±0.09,差异均有统计学意义(P=0.025、0.017);B6-Co小鼠E16.5 d和E17.5 d眼睑组织中SRF蛋白的表达水平分别为0.08±0.01和0.08±0.01,明显低于B6小鼠的0.12±0.03和0.13 ±0.02,差异均有统计学意义(P=0.036、0.024);而2种小鼠间E18.5 d时眼睑组织中SRF mRNA及其蛋白的表达量差异均无统计学意义(P=0.387、0.774).免疫荧光染色显示,SRF蛋白多表达于B6-Co小鼠和B6小鼠眼睑组织的角质层细胞,但B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞中SRF蛋白表达的荧光强度明显弱于B6小鼠.结论 SRF在B6-Co小鼠眼睑组织中的表达量明显下调,SRF可能参与眼睑发育缺陷的发生过程.
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纤维母细胞生长因子10基因在角膜混浊小鼠中的克隆测序与表达研究
目的：研究纤维细胞生长因子10（Fgf10）基因在角膜混浊小鼠（B6-Co ）中的克隆测序及表达。方法正常小鼠（C57BL/6，B6）和B6-Co小鼠交配，取胚胎16．5 d B6和B6-Co小鼠皮肤组织，提取总RNA并逆转录，采用逆转录聚合酶链反应（PCR）技术分段扩增目的基因，连接T载体，转化感受态细胞，筛选阳性克隆，并测序分析；采用实时荧光PCR的方法进一步检测该基因在B6-Co小鼠中的表达。结果测序发现在 Fgf10基因第三外显子1914 bp和1915 bp之间插入了碱基 A ；实时荧光PCR结果显示Fgf10在B6-Co小鼠中的表达明显下降（P＜0．05）。结论 Fgf10与B6-Co小鼠出生时眼睑开放（EOB）表型有关，其表达调控机制有待进一步研究。
关键词： B6-Co小鼠 角膜混浊 纤维细胞生长因子10 基因表达 突变
