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FMMU白化豚鼠类鼻疽病模型的建立
目的 建立FMMU白化豚鼠类鼻疽动物模型.方法 类鼻疽杆菌腹腔接种FMMU白化豚鼠建立感染模型,观察模型动物外观、血液含菌量、死亡率以及主要脏器病理学变化,电子显微镜观察豚鼠白细胞杀灭类鼻疽杆茵作用.结果 感染豚鼠出现疾病征象,造模后72 h内血液含菌量达到约1 4000CFLJ/ml,造模后96h死亡率70%,光镜观察发现主要在脾,淋巴结、肝等实质器官中存在典型的化脓灶,电镜观察表明豚鼠白细胞具有杀灭类鼻疽杆菌作用.结论 成功建立FMMU白化豚鼠类鼻疽杆菌感染模型,可作为人类的急性类鼻疽病动物模型用于相关研究.
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类鼻疽疫区人群类鼻疽血清抗体调查
类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)广泛分布于热带和亚热带的泥土之中,通过受损的皮肤和呼吸道侵入机体引起人和动物的类鼻疽病(Melioid-osis).我国的类鼻疽疫区主要在海南岛、雷州半岛、湛江、及惠州等地,动物类鼻疽通过剖杀血清学阳性的猪已得到证实[1,2 ].由于疫区临床医生不了解类鼻疽,研究人员刻意去搜寻和发现人类鼻疽病例实属困难,这一问题直到上世纪90年代初才得以解决.李俐等首先在海南省报道了我国第一例人类鼻疽病例_],次年,唐德森等在湛江发现了4例人类鼻疽[4],随后有多例病例报道[5].类鼻疽杆菌的感染没有特有的临床症状,加之目前临床医生对该病的了解很少,所以现在很难把握疫区有多少人被误诊.本文用类鼻疽杆菌外毒素致敏红细胞,对疫区人群抗体进行了调查,结果如下:
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类鼻疽杆菌败血症并脾脓肿、糖尿病一例
患者男,46岁,因发热,咳嗽2周入院.病程中体温每天均高达42℃,体左腰隐痛,曾用头孢菌素治疗无效,有2型糖尿病12年,1年多前发现脾脓肿,当地抗感染治疗10余天好转.有饮酒史.
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类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1617蛋白的重组表达及其抗体制备
目的 构建重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1617,并制备其抗体.方法 采用PCR扩增BPSS1617全长序列,克隆至原核表达载体pET-22b,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体,并通过Western blot、免疫荧光和ELISA检测抗体的特异性,并分析该蛋白在类鼻疽杆菌中的亚细胞定位.结果 成功扩增类鼻疽杆菌BPC006株基因组中的BPSS1617基因;酶切和测序验证重组表达质粒pET-22 b-BPSS 1617构建成功;经IPTG诱导表达、包涵体洗涤、纯化以及变性复性,成功获得纯度＞95％,分子量为25×103的目的蛋白;将纯化的BPSS1617重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗BPSS1617蛋白多克隆抗体,经实验验证其特异性良好;同时BPSS1617蛋白主要定位于类鼻疽杆菌的细胞质中.结论 成功构建、表达、纯化获得BPSS1617蛋白,并成功制备了其特异性多克隆抗体,并且该蛋白定位于类鼻疽杆菌的细胞质中.
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类鼻疽杆菌慢性感染BALB/c小鼠模型的建立
目的 建立类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)慢性感染BALB/c小鼠模型并评价其稳定性.方法 采用0.01 mL洗涤后的高、中、低剂量的类鼻疽杆菌液(菌量分别为3.3×104、3.3×103、3.3×102 CFU)滴鼻感染BALB/c小鼠,密切监测42 d,记录小鼠的生存率,探索合适的攻毒剂量.在低剂量细菌(3.3×102 CFU)感染小鼠后21、28、35、42 d,计数小鼠血液、肝脏、脾脏和肺脏的细菌定植量,ELISA检测血清炎性因子TNF-α、IFN-γ的表达和血清类鼻疽杆菌特异性IgG抗体滴度,观察肝脏、脾脏和肺脏等主要器官的病理学改变,评价动物模型的稳定性.结果 低剂量类鼻疽杆菌滴鼻感染BALB/c小鼠后,小鼠42 d生存率为60％.期间小鼠体质量呈下降趋势,血液、肝脏、脾脏和肺脏均有细菌定植,并出现大量炎性细胞浸润、多灶性坏死和脓肿等病理改变;类鼻疽杆菌血清中特异性IgG抗体滴度从感染后21 d起持续增高;实验组小鼠血清炎性因子TNF-α和IFN-γ表达明显高于对照组(P＜0.05).结论 成功建立了稳定的类鼻疽杆菌慢性感染BALB/c小鼠模型.
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类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定
目的 重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布.方法 以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位.结果 从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×103的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1:1280000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应.亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质.结论 重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质.
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类鼻疽杆菌毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性
目的 重组、表达类鼻疽杆菌毒素BLF1并研究其生物学活性.方法 运用DNA重组技术,以pGEX为表达系统在大肠杆菌中表达BLF1蛋白;以纯化重组蛋白rBLF1免疫新西兰大白兔,获得抗rBLF1血清,Western blot及ELISA鉴定抗血清;不同浓度rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,观察小鼠生存率;A549细胞模型中,通过CCK-8实验研究目的蛋白的细胞毒性效应及抗体阻断作用.结果 从类鼻疽杆菌基因组DNA中PCR得到了BLF1目的基因,连接到pGEX-6p-2质粒,经双酶切及测序表明重组质粒构建成功.GST-BLF1蛋白经诱导表达、酶切纯化得到了相对分子质量为23×103的高纯度rBLF1,免疫家兔抗血清ELISA效价达1∶1 280 000,Western blot鉴定在目的蛋白位置处出现特异印记条带.重组rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率与蛋白剂量呈正相关.rBLF1蛋白能明显杀伤A549细胞,抗体可有效阻断其杀伤作用.结论 成功重组表达了具有生物活性的rBLF1,该蛋白具有明显杀伤A549肿瘤细胞的作用,同时能够导致小鼠死亡但表现出一定耐受性.
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类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157:H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究
目的 融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质.方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性；EspA-FlC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性.结果 获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319；实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25％,纯化后蛋白纯度超过85％.Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157:H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应.EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC 、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC.结论 重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性.此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础.
关键词： 类鼻疽杆菌 鞭毛蛋白FliC 肠出血性大肠杆菌O157 EspA 疫苗
