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小鼠睾丸gdnf基因的克隆及其在支持细胞中的表达
目的:从小鼠睾丸中克隆胶质细胞源神经营养因子基因gdnf,构建真核表达载体,并转染支持细胞,以便用作培养精原干细胞(SSCs)的滋养层.方法:以正常成年昆明鼠为材料,提取小鼠睾丸组织中总RNA后,以RT-PCR技术克隆小鼠睾丸gdnf基因,构建真核表达载体,并转染TM4细胞(睾丸支持细胞株),在转染后40 h进行免疫荧光鉴定.结果:成功克隆小鼠睾丸gdnf基因的cDNA,测序正确,免疫荧光细胞染色显示转染后的支持细胞中有GDNF蛋白表达.结论:本研究为以转染了gdnf基因的支持细胞作饲养层培养SSCs奠定了基础.
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慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究
目的：观察改良Tet-On系统修饰慢病毒( Lv-TH-GD-NF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法①用 Lv-TH-GDNF 与 rtTA2s-M2病毒感染 HeLa 细胞,免疫印迹法检测强力霉素( Dox )对TH、GDNF基因表达的调控。②用 Lv-TH-GDNF 与 rtTA2s-M2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡( APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体 DA、DOPAC 含量评估 Lv-TH-GDNF治疗效应；通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果①在体外HeLa细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。②在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善( P<0．01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高( P<0．01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-TH-GDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。
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胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染神经干细胞实验研究
目的 探讨神经干细胞转染的新方法,并观察转染后目的 基因的表达情况.方法 原代培养神经干细胞,运用jet PEI转染试剂将目的 基因胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和内皮素B受体基因(EDNRB基因)共转染至神经干细胞内,免疫荧光显微镜观察、流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,测定转染效率,RT-PCR检测目的 基因表达情况.结果 成功培养出可用于基因转染的神经干细胞,转染后24h即可在免疫荧光显微镜下观察到GFP表达,流式细胞仪显示24、48和72 h转染效率分别为15.36%、24.67%和25.73%.RT-PCR显示目的 基因在神经干细胞内成功表达.结论 运用iet PEI成功将目的 基因转染至神经干细胞内,为相关神经变性痍病的基因治疗打下了实验基础.
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GDNF基因体内转染对大鼠面神经运动神经元的保护作用
目的:研究GDNF基因体内转染对大鼠面神经损伤后运动神经元的保护作用,为基因治疗周围神经损伤提供依据.方法:用脂质体介导pEGFP-GDNF cDNA基因转染受损面神经所支配的面肌,荧光显微镜和免疫组化法分别检测面肌和面神经运动神经元内GDNF的表达.计算损伤侧面神经元的存活率.结果:转染侧面肌细胞内有绿色荧光.面神经损伤后的第7、14、21和28d时间段,对照组面神经运动神经元的存活率分别为93.06%、76.06%、72.38%和70.69%,转染组分别为94.00%、84.00%、79.25%和78.06%.转染组面神经运动神经元GDNF的表达高于对照组.结论:面神经损伤后经脂质体介导GDNF基因体内转染靶器官后,对受损面神经运动神经元有保护作用.
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GDNF基因多态性与精神分裂症临床特征的相关性
目的 探讨GDNF基因多态性与精神分裂症临床特征的相关性.方法 对符合纳入标准的精神分裂症病例组及健康对照组进行临床资料收集及血样的采集,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测GDNF基因多态性.选取GDNF基因2个SNP位点:rs2973050,rs2910702.所有数据应用SSPS13.0软件包处理.结果 ①哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg's equilibrium)结果显示,GDNF基因rs2910702在病例组中偏离哈迪温伯格平衡(x2=24.983,P=0.000);②GDNF等位基因频率在病例组与对照组中的分布无统计学差异(P＞0.05),但基因型频率分布有统计学差异(P＜0.05);③GDNF各基因型与精神分裂症的临床分型、PANSS量表各因子分无明显相关性.结论 rs2973050基因型C/C、rs2910702基因型G/G可能与精神分裂症的发生有关,为精神分裂症的危险基因型.
