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Smad 6调控STAT3活性促进胶质瘤细胞的增殖
目的 研究Smad 6对人脑胶质瘤细胞增殖能力的影响及其机制.方法 采用Western blot 检测原代胶质瘤细胞核中Smad 6的表达水平.构建慢病毒介导的细胞核稳定过表达和敲减Smad 6的胶质瘤细胞株;CCK8细胞增殖和EdU掺入增殖实验检测Smad 6对胶质瘤细胞增殖能力的影响;干细胞成球实验检测Smad 6对胶质瘤干细胞样细胞自我更新能力的影响.裸鼠皮下荷瘤模型检测Smad 6对胶质瘤细胞体内成瘤能力的影响;荧光素酶报告基因和Western blot检测Smad6对STAT3靶基因的调控,分析Smad 6对信号转导和转录激活因子3(STAT3)活性的调节作用.结果 Western blot和细胞增殖实验显示,原代胶质瘤细胞核中Smad 6表达水平与细胞增殖能力相关.成功构建Smad 6细胞核稳定过表达和敲减胶质瘤细胞株;核Smad 6过表达显著促进胶质瘤细胞的增殖和干细胞样细胞的自我更新能力,而Smad 6敲减则显著抑制胶质瘤细胞的增殖和干细胞样细胞的自我更新能力.细胞核Smad 6促进胶质瘤细胞中STAT3的转录调控活性及其靶基因的表达.结论 胶质瘤细胞核中Smad 6通过调控STAT3的转录调控活性,促进胶质瘤细胞的增殖和干细胞样细胞的自我更新能力.
关键词： Smad 6 信号转导和转录激活因子3 胶质瘤 增殖 -
Smad 4、Smad 6、Smad 7在胰腺癌中的改变及其相互关系
目的研究Smad 4、Smad 6和Smad 7在胰腺癌组织中的改变及其相互关系.方法采用半定量RT-PCR法分别检测了17例胰腺癌和6例正常胰腺组织中Smad 4、Smad 6和Smad 7的mRNA表达情况.结果5例胰腺癌组织不表达Smad 4,占29.4%;胰腺癌组织中Smad6和Smad7的表达水平分别为1.15±0.51和1.44±0.84,正常胰腺组织S mad6和Smad 7的表达水平分别为0.47±0.18和0.39±0.29,两者相比有统计学意义(P＜0.05);Smad6和Smad7的表达水平和Smad4表达无相关性.结论Smad4纯合性缺失在胰腺癌中的发生率约为30%,在胰腺癌的发病机制中占有值得重视的地位;Smad 6和Smad 7在胰腺癌组织中存在过表达现象,可能是导致胰腺癌发生的原因之一.
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Smad 6和Smad 7基因治疗对肾小管间质纤维化进程的影响
目的观察腺相关病毒(rAAV)介导的Smad 6和Smad 7基因治疗对单侧输尿管梗阻性(UUO)肾小管间质纤维化进程的影响.方法构建产生表达Smad 6和Smad 7基因的无辅毒腺相关病毒载体,再将此病毒颗粒通过肾动脉途径转移到UUO模型.30只Wistar大鼠随机分为假手术组、梗阻组、LacZ AAV转染组、Smad 6 AAV转染组和Smad 7 AAV转染组(n=6),于术后第3周处死大鼠.采用β-半乳糖苷酶染色和免疫组化观察外源基因的定位,Western印迹法观察外源基因、胞内磷酸化Smad 2、PAI-1和α-SMA的表达;底物酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性,分光光度法测定肾组织羟脯氨酸含量.结果Smad 6和Smad 7成功地转染到外髓的肾小管间质区,定位在肾小管和集合管细胞,而血管细胞、肾小球或间质细胞均未见有AAV转移基因的表达.Smad 7基因治疗可显著降低肾组织PAI-1、α-SMA的表达和肾组织羟脯氨酸含量,增加MMP-2和MMP-9活性,这些作用与Smad 7阻断Smad 2磷酸化有关.相反,Smad 6没有这样的治疗作用.结论Smad 7基因转移能有效缓解单侧输尿管梗阻肾小管间质纤维化,AAV介导的Smad 7基因转移有望成为治疗肾小管间质纤维化的方法之一.
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抑制性 Smads 在肝纤维化发生发展中的表达变化
目的：观察抑制性 Smads（Smad 6，Smad 7）在肝纤维化大鼠肝脏中的表达变化并探讨它们在肝纤维化发生发展中可能的作用。方法选取 Wistar 大鼠20只，随机分为正常组和肝纤维化模型组，每组各10只。通过皮下注射40％ CCl4植物油溶液制备肝纤维化动物模型，注射剂量为0．4 mL／100 g 体质量，每周注射2次，造模时间总计为12周。采用 Western Blot 检测肝脏中 Smad 6及 Smad 7蛋白的表达变化；采用 PCR 技术检测肝脏中Smad 6及 Smad 7 mRNA 的改变。结果 Western Blot 检测显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肝脏中 Smad 6及Smad 7蛋白的表达显著减少；同时 PCR 检测发现模型组大鼠肝脏中 Smad 6及 Smad 7 mRNA 的表达也较正常组大鼠明显降低。结论肝纤维化过程中抑制性 Smads 在基因及蛋白水平表达下调可能是促进肝纤维化发生发展的一个重要因素。
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Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒载体的构建及其表达
目的: 构建Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒(AAV)载体, 并转染到人肾小管上皮细胞中表达.方法: 利用基因重组技术, 采用BamH I和Xho I双酶分别将pcDNA3中的目的基因Smad 6/flag和Smad 7/flag融合基因片断切出, 再克隆到质粒pAAV-MCS中, 构建重组质粒pAA-Smad 6/flag和pAA-Smad 7/flag.采用磷酸钙沉淀法, 以重组质粒或pAAV-LacZ以及pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞, 产生均有传染性的病毒颗粒.再将此病毒颗粒转染到培养的人肾小管细胞中, 用免疫组化法检测其Smad 6和Smad 7转移基因的表达.结果: 成功地构建Smad 6和Smad 7基因的腺相关病毒载体, 并可在肾小管上皮细胞中表达Smad 6和Smad 7.结论: 肾小管细胞能稳定、高效表达外源Smad 6和Smad 7, 为今后建立Smad 6和Smad 7 AAV基因治疗体内肾纤维化的模型奠定了良好的基础.
