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ClC-3氯通道参与TGF-β通路调控PTH的促成骨分化作用机制研究
目的：：初步探究电压门控氯通道3(ClC-3)在甲状旁腺激素(PTH)调节成骨分化过程中的作用机制。方法：采用基因转染的方法,分别用特异性siRNA调节成骨细胞MC3T3-E1中转化生长因子β1(TGF-β1)及ClC-3基因的表达水平,采用实时定量RT-PCR检测ClC-3、TGF-β1及碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白(BSP)、骨钙素(OC)、核心结合蛋白因子2(Runx2)等成骨相关因子的基因表达情况,并用Western blot及免疫荧光方法检测CLC-3和TGF-β1蛋白的表达情况。结果：在PTH间断刺激下,成骨细胞中仅干扰TGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强；仅干扰ClC-3氯通道基因后,TGF-β1基因及蛋白表达水平升高。同样在PTH间断刺激下,在分别干扰ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后,成骨相关基因表达水平较对照组明显降低(P<0.05)；然而共同干扰两者之后成骨相关基因表达较对照组无明显差异(P>0.05)。结论：ClC-3氯通道通过TGF-β通路参与介导了PTH在成骨细胞中促进成骨细胞分化的作用。
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ClC-3氯通道调节氧糖剥夺所诱导的小胶质细胞的表型转化
目的:研究ClC-3氯通道在氧糖剥夺所致小胶质细胞表型转化中的作用.方法:应用小胶质细胞株(BV-2)制备氧糖剥夺模型,分别给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB预处理BV-2细胞.通过MTT活性测定确定BV-2细胞损伤及药物的有效浓度;通过实时荧光定量PCR法测定细胞表型相关分子,如M1型相关分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β (interleukin 1β,IL-1β)、CD86]和M2型相关分子[转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、CD206]mRNA水平的表达;通过RNA干扰的方法下调ClC-3的表达,再给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB干预,进一步检测细胞的MTT活性,观察药物作用效果.结果:预先给予DIDS(1和10 μmol/L)和NPPB(1 μmol/L)能够改善氧糖剥夺所诱导的BV-2细胞MTT活性下降,抑制M1型相关分子如TNF-α、IL-1β和CD86的表达并促进M2型相关分子(TGF-β和CD206)的表达;通过RNA干扰下调ClC-3的表达,能够消除DIDS和NPPB的作用.结论:ClC-3氯通道参与调控氧糖剥夺所致小胶质细胞的表型转化,阻断ClC-3氯通道抑制氧糖剥夺诱导小胶质细胞向M1型转化.
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ClC-3在 SIN-1诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用
目的：探讨ClC-3氯通道在NO供体SIN-1诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用。方法：取离体培养12 d的SD大鼠海马神经元，分为对照组、SIN-1组和SIN-1＋DIDS组。对照组不作处理，SIN-1组加入终浓度为0．5mmol /L SIN-1作用18 h，SIN-1＋DIDS组加入终浓度为0．5 mmol/L SIN-1和0．1 mmol/L DIDS作用18 h。采用细胞免疫荧光染色和免疫印迹技术检测各组 ClC-3氯通道蛋白的表达，实时定量PCR技术检测各组ClC-3氯通道mRNA 的表达。结果：各组Caspase3-和ClC-3氯通道表达的差异有统计学意义（蛋白：FCaspase-3＝118．330，P＜0．001；FClC-3氯通道＝102．750，P＜0．001；mRNA：FClC-3氯通道＝32．955，P＜0．001）。 SIN-1诱导凋亡神经元ClC-3氯通道蛋白表达增强，氯通道阻断剂DIDS削弱ClC-3氯通道的表达。结论：ClC-3氯通道可能参与SIN-1诱导大鼠海马神经元的凋亡。
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氯通道对血小板活化标志物PAC-1和P-选择素的影响
目的：探讨氯通道对血小板活化标志物PAC-1和P-选择素的影响。方法：采用Western blot和免疫荧光技术检测ClC-3在人外周血来源的血小板上的表达；ADP(20μM)不同时间点(15、30、60、120、180 min)处理血小板后，Western blot检测ClC-3蛋白的表达变化；利用流式细胞术检测空白对照组， ADP组，DIDS(100μM)+ADP组，NFA(100μM)+ADP组，NPPB(100μM)+ADP和低氯对照组，低氯+ADP组的血小板活化分子标志物PAC-1和P-选择素的表达变化。结果：在健康成人外周血分离的血小板上表达ClC-3蛋白；ADP时间依赖性地处理血小板，ClC-3蛋白表达呈增加趋势，15 min相较于空白对照组已有统计学意义(P<0.05)；ADP组PAC-1(32.13%±2.0%)及P-选择素(52.32%±5.31%)表达均高于空白对照组(1.76%±0.41%，1.89%±0.32%，P<0.01)；低氯对照组PAC-1(8.01%±1.36%)和P-选择素(12.19%±0.84%)的表达与空白对照组相比，均上调(P<0.05)；与ADP组PAC-1相比， DIDS+ADP(5.62%±1.22%)，NFA+ADP(1.96%±0.54%)和NPPB+ADP(3.56%±0.79%)组表达降低，低氯+ADP组(45.26%±4.43%)表达增加(P<0.01)；与ADP组P-选择素相比，DIDS+ADP(16.64%±1.52%)， NFA+ADP(4.97%±0.64%)和NPPB+ADP(8.56%±2.04%)组表达均降低，低氯+ADP组(73.33%±3.80%)表达增加(P<0.01)。结论：人血小板上ClC-3氯通道参与血小板的活化，氯通道阻断剂抑制ADP诱导的血小板活化，降低血小板胞外氯浓度可促进ADP诱导的血小板的活化。
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ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展
细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程,如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等[1, 2].在低渗环境刺激下,容积激活性氯通道参与细胞容积调节,对维持细胞容积起着重要调节作用.
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敲低 IK1钾通道抑制 ClC－3氯通道的表达和功能
目的：探讨ClC－3氯通道是否为IK1钾通道的调节靶点，重点研究鼻咽癌细胞IK1钾通道对ClC－3氯通道功能及蛋白表达的影响。方法：采用siRNA转染技术抑制低分化鼻咽癌上皮细胞（ CNE－2Z） IK1基因的表达；real－time PCR技术检测ClC－3 mRNA的表达；Western blot检测ClC－3的蛋白表达；细胞免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测ClC－3和IK1蛋白在细胞内分布；全细胞膜片钳记录细胞氯电流。结果：IK1 siRNA可以成功转染CNE－2Z细胞，有效抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达；用IK1 siRNA抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达后， ClC－3的mRNA表达上调而ClC－3蛋白却表达减少：在低分化鼻咽癌上皮细胞，低渗刺激可激活氯通道，产生一个较大的氯电流，在成功转染IK1 siRNA的细胞，此氯电流明显减弱。结论：敲低IK1钾离子通道可抑制ClC－3氯离子通道的表达和功能。
