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人皮肤成纤维细胞原代培养方法的改良
目的:改良人皮肤成纤维细胞培养方法.方法:采用培养后组织块消化法(简称改良法)培养成纤维细胞,以组织块贴瓶法(简称贴瓶法)作为对照.结果:改良法成功率为100%,43 d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代;贴瓶法成功率为66.7%,47 d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代.结论:改良法是一种可行的成纤维细胞培养方法.
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胎牛血清促进色素上皮衍生因子在皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中的表达
目的:探讨表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中色素上皮衍生因子(PEDF) 表达的影响因素.方法:体外培养角质形成细胞和成纤维细胞,并以10%FBS(胎牛血清)刺激,通过免疫荧光和Western blot检测PEDF的表达.结果:PEDF大多位于细胞浆中,但在细胞核中也有少量表达.细胞浆中PEDF并非均质型分布,而是呈细颗粒状集聚.10%FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达,而且这一分布形式不受组胺和佛波肉豆蔻醋酸(PMA) 的影响.结论:10% FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达.
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人巩膜成纤维细胞体外三维胶原基质培养系统的构建及其生物力学特性
背景 眼轴的过度伸长和巩膜组织的扩张是高度近视发病机制研究的热点之一,建立合理的人巩膜成纤维细胞(HSFs)培养体系模型有助于进一步探讨HSFs在高度近视形成过程中与胶原基质相互作用的生物学机制. 目的 构建HSFs与Ⅰ型胶原的三维培养系统,微观模拟在体巩膜,建立巩膜重塑模型.方法 采集新鲜供体巩膜组织,采用组织块培养法分离和培养HSFs,采用免疫荧光技术检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定细胞;获取8周龄SPF级雄性SD大鼠鼠尾腱制备鼠尾胶原,400μl胶原加入50μ1NaOH(0.1 mol/L)溶液中混匀,加入80μl 10倍培养液,混匀,溶液pH值约为7.加入1 100μl终浓度1×106/ml细胞悬液混合形成凝胶培养系统,于倒置相差显微镜下观察HSFs的增生情况和细胞形态,采用IPP-5软件对三维培养的含细胞胶原收缩面积进行测量以分析三维胶原系统的物理特性;采用生物力学试验机对三维胶原系统的生物力学特性进行测定.结果 培养的HSFs波形蛋白呈阳性表达,角蛋白表达阴性.未接种培养细胞的无成纤维细胞SD鼠鼠尾胶原凝胶透明,实验期间性状无明显变化,而含HSFs的三维胶原凝胶随着细胞培养时间的延长细胞数量增加,倒置相差显微镜下可观察到数十层成纤维细胞相互交错呈网状排列,培养后7 ～14d凝胶块呈乳白色,凝胶面积保持在正常的10％左右,三维培养系统中的HSFs接种后24 h细胞产生多向性突起,呈双极形或纺锤形.HSFs胶原凝胶复合物的弹性材料蠕变曲线呈非线性(0 ～ 100 s)部分与线性(100 ～600 s)部分,前者是胶原凝胶在短暂应力的作用下本身的弹性变化,后者是胶原凝胶在定力的作用下随拉伸时间的延长而出现的蠕变变化. 结论 鼠胶原凝胶对培养的HSFs有良好的生物相容性,HSFs胶原凝胶可形成三维复合物,可呈现机械性生物学特性,是研究成纤维细胞与细胞外基质之间以及细胞之间相互作用的良好模型,可用于巩膜重塑的模拟研究.
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抗青光眼术后滤过泡瘢痕化组织人Tenon囊成纤维细胞的生长特性
背景 抗青光眼滤过术后瘢痕组织中的主要细胞成分是人Tenon囊成纤维细胞(HTFs),探讨滤过泡瘢痕组织中HTFs的生长特性可为抗青光眼滤过术后预防瘢痕形成的研究提供实验基础. 目的 研究抗青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化组织中HTFs的体外生长特性. 方法 收集因抗青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化行二次手术的患者8例8眼的Tenon囊组织(4 mm×5 mm),同期以同样的取材方法收集行斜视矫正术患者8例8眼的正常Tenon囊组织.采用组织块贴壁法将Tenon囊组织进行原代培养,用鼠抗人波形蛋白细胞免疫荧光法鉴定培养的HTFs,并用巢式PCR法检测培养的HTFs中是否受到支原体的污染.分别于第0、4、7、11、14天以发光法细胞活力检测HTFs,并绘制各组细胞的生长曲线,计算细胞群体倍增时间(PDT).比较瘢痕组和正常组HTFs形态学和PDT的差异;将瘢痕组第5代与第15代HTFs的形态及PDT进行比较,评价细胞传代生长特性的稳定性. 结果 HTFs原代培养1～2周达到融合,呈长梭形,形态符合HTFs,传代细胞4～6 d达到融合.瘢痕组与正常组HTFs的生长特性相近,对鼠抗人波形蛋白抗体呈阳性反应,PCR检测未见支原体反应条带.瘢痕组和正常组HTFs的PDT分别为(20.54±3.51)h和(18.86±2.91)h,差异无统计学意义(t=0.634,P=0.561).细胞培养后第4、7、11和14天,瘢痕组HTFs的细胞数与正常组比较差异均无统计学意义(t=2.663,P=0.081;t=0.194,P=0.863;t=3.338,P=0.053;t=0.627,P=0.565),2个组的HTFs随培养时间的延长显示出一致的增生曲线.瘢痕组第5代和第15代细胞PDT分别为(20.54±3.51)h及(22.84±4.15)h,差异无统计学意义(t=0.733,P=0.505);第5代与第15代间细胞生长曲线可见其增生能力均稳定,两代间HTFs在各时间点的细胞数差异均无统计学意义(t=1.528,P=0.235;t=0.269,P=0.786;t=1.954,P=0.139;t=0.730,P=0.506).结论 抗青光眼术后滤过泡瘢痕化患者的HTFs体外培养生长状态良好,增生能力稳定,是进行青光眼术后滤过区抗纤维化研究的良好靶细胞.
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紫杉醇对人Tenon囊成纤维细胞增生的抑制作用及机制
背景 人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的异常增生是导致抗青光眼滤过手术失败的主要原因.寻找抑制HTFs增生的药物对抑制青光眼术后功能性滤过泡的瘢痕化有重要意义. 目的 观察紫杉醇对体外培养的HTFs增生、凋亡、细胞周期以及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达的影响.方法 收集抗青光眼滤过术中切除的人眼Tenon囊组织,用组织块培养法培养HTFs并进行传代,取3～6代细胞用于实验.采用小鼠抗人角蛋白抗体、小鼠抗人波形蛋白抗体、小鼠抗人结蛋白抗体、小鼠抗人S-100抗体行免疫组织化学染色鉴定培养的HTFs.在培养基中分别加入0、1×10-8、1 × 10-7、1 × 10-6 mol/L紫杉醇,采用实时细胞电子分析系统(RT-CES)观察不同浓度紫杉醇作用后HTFs的细胞指数变化；采用DAPI染色法观察各组细胞的凋亡情况；用流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用后HTFs各细胞周期比例；采用实时定量PCR(real-time PCR)和ELISA法检测各组HTFs中MMP-1 mRNA和蛋白的表达量,分别以MMP-1 mRNA/GAPDH mRNA和MMP-1蛋白质量浓度(μg/L)表示.结果 组织块原代培养7d内可见细胞游出,呈长梭形和不规则三角形,培养的细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,而抗角蛋白抗体、抗结蛋白抗体和抗S-100抗体染色阴性.培养基中加入紫杉醇作用24 h后,1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L紫杉醇组平均细胞指数值分别为1.093±0.191、0.665±0.093和0.473±0.117,均明显低于0 mol/L紫杉醇组的1.514±0.283,差异均有统计学意义(均P=0.000)；紫杉醇作用后,HTFs的细胞核内可见呈DAPI蓝色荧光的颗粒状物质,荧光强度随着紫杉醇浓度的增加而增强.1×10-8、1×10-7、1×10-6 moL/L紫杉醇分别作用12h后,G2/M期HTFs的比例分别为(9.20±0.80)％、(12.37±0.45)％和(13.80±0.35)％,明显高于0 mol/L紫杉醇组的(7.17±0.50)％,差异均有统计学意义(P=0.005、0.000、0.000).与0 mol/L紫杉醇组比较,1×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6 mol/L紫杉醇作用30 min后HTFs中MMP-1mRNA的相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义(均P=0.000)；1×10-8、1×10.、1×106mol/L紫杉醇作用24 h后,HTFs中MMP-1蛋白的表达量均明显低于0 mol/L紫杉醇组,差异均有统计学意义(P=0.010、0.002、0.001).结论 1×10-8 ～ 1×10-6 mol/L紫杉醇可抑制体外培养HTFs的增生,诱导细胞凋亡,阻断细胞的有丝分裂,其作用机制可能与下调细胞中MMP-1的表达有关.
