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肽类生长因子及苏拉明对体外培养人脐静脉内皮细胞生长的影响
目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和苏拉明(suramin)对体外培养人脐静脉内皮细胞生长(HUVEC)的影响,旨在探讨他们在肿瘤血管生成和抗肿瘤血管生成中的作用.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞EV-304,一组用不同浓度的bFGF(0.01、0.1、1.0、10、100 ng/mL)进行培养,另一组在用不同浓度的苏拉明(0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L)培养6 h后加入浓度为10 ng/mL的bFGF再进行培养.结果:bFGF 可明显刺激内皮细胞的生长,而 Suramin 可阻止 bFGF 对内皮细胞的生长刺激.结论:苏拉明对体外培养内皮细胞的生长抑制作用可能是通过中和肽类生长因子如bFGF及引起内皮细胞凋亡来实现的.
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人脑胶质瘤细胞原代培养实验模型的构建
目的:探索人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,提高原代培养的成功率,快速构建人脑胶质瘤细胞体外试验模型.方法:分别采用组织块培养法和酶消化法对12例人脑胶质瘤细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果;通过倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学特点;通过生长曲线的测定研究体外培养细胞的生长特性.结果:原代人脑胶质瘤细胞短期培养成功,并可传代.经组织块培养法成功率较低为33.3%;经酶消化法短期培养成功率为83.3%,明显高于组织块培养法.培养成功的细胞状态稳定,增殖活跃,有明显的对数生长期.结论:用酶消化法可进行人脑胶质瘤短期体外培养,且成功率较高,适宜建立体外细胞培养模型.
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连续植块培养原代成骨细胞及其特性的比较
目的: 探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法,并比较其特性.方法: 收集1～4次连续植块培养获得的SD乳鼠颅盖骨原代成骨细胞,观察第1～4次连续植块培养获得的成骨细胞在细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素和BMP-2免疫组织化学表达的变化.结果:连续植块培养收集的1～4次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,Gomori改良钙-钴法ALP活性,骨钙素及BMP-2免疫组织化学染色表达上,均没有明显的区别.结论: 连续植块培养可获得与植块培养性状相同的SD乳鼠原代成骨细胞,且细胞数量多,节约经费、时间,操作简便.
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人骨髓间充质干细胞的优化培养
目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)培养大多集中在动物,探讨人MSCs的优化培养方法,为组织工程临床应用奠定基础.方法:手术切取患者骨松质3 mm×3 mm×3 mm,在含血清培养基内用剪刀将其剪为1 mm×1 mm×1 mm大小,然后用注射器冲洗;抽取患者骨髓5 mL.分别用贴壁法和密度梯度离心法原代培养.比较不同培养方法MSCs的生长情况.对各组传代细胞用化学药物进行成骨诱导培养,并检测成骨细胞表型.结果:手术切取患者骨松质和抽取患者骨髓均能培养出骨髓间充质干细胞,切取骨松质获取的细胞数量大,5mL骨髓培养细胞数平均可达2.43×10s,3 mm×3mm×3 mm骨松质可以获取MSCs的平均细胞数可达9.57×108;全骨髓法细胞贴壁时间早两三天,密度梯度离心法细胞均一性好,利于纯化.结论:临床组织工程中可以根据情况和需要采用不同方法获取MSCs.
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四种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响
目的:探讨吲哚美辛、雷公藤多甙、甲氨蝶呤、地塞米松4种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响,为类风湿性关节炎患者临床用药,改善其功能提供依据.方法:实验于2003-05/2004-02在的第一军医大学细胞生物实验室完成.类风湿性关节炎及正常滑膜组织,分别来源于第一军医大学南方医院脊柱骨病科和汕头市第二人民医院外二科因类风湿性关节炎而行全膝关节置换术或经关节镜滑膜切除术的患者和无关节炎病史的创伤性截肢患者,用原酶消化法获得成纤维样滑膜细胞.用第2～4代细胞在接种12 h后分别加入上述药物处理24 h,在第5和第10天分别用四甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖情况并统计分析.结果:雷公藤、甲氨蝶呤第5天对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑制率分别为(46.14±4.20)%和(31.52±2.86)%,第10天分别(47.00±1.89)%和(46.73±3.83)%.消炎痛及地塞米松对成纤维样滑膜细胞增殖无明显抑制作用.这种抑制作用对于类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖尤为明显.雷公藤多甙比甲氨蝶呤对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑制作用有更明显的时间依赖性.结论:雷公藤、甲氨蝶呤对于类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖有明显抑制作用,适当延长甲氨蝶呤用药间隔时间对于抑制滑膜组织过度增生及血管翳的形成效果可能相似.
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BXSB狼疮小鼠胸腺上皮细胞培养方法的建立
目的:比较不同培养条件下原代狼疮小鼠胸腺上皮细胞生长情况.方法:分别采用剪切法、剪切加胶原酶消化法、剪切加胰蛋白酶消化法建立培养体系获取自发性系统性红斑狼疮小鼠(BXSB小鼠)胸腺上皮细胞;用光镜、免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定.结果:含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出较纯的胸腺上皮细胞;剪切法成纤维细胞污染较多,剪切加胰蛋白酶消化法细胞生长状态较差,经剪切加胶原酶消化的BXSB胸腺植块,生长状态好,成纤维细胞污染少;当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95%以上.结论:剪切加胶原酶消化法仅用含血清的培养基即可培养出符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,是低成本、简便易行的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系.
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新生小牛视网膜水平细胞生长发育特性的体外实验
目的:研究新生小牛视网膜水平细胞在体外培养中的生长发育规律.方法:分离培养新生小牛视网膜神经细胞,将培养10、20、30和40 d的细胞进行免疫细胞化学染色,采用Calbindin-D28K抗体标记视网膜水平细胞,用图像分析系统定量测量阳性细胞的免疫反应强度.结果:培养10 d的水平细胞还不具备典型的形态特征,培养20 d时阳性细胞的形态特征与成熟的水平细胞一致.培养30 d和40 d的水平细胞的形态特点和培养20 d时相似.定量分析显示体外培养20 d时阳性细胞免疫反应强度较10 d时有增加趋势.体外培养30 d和40 d时,阳性的水平细胞免疫反应强度较培养10 d和20 d时均明显减弱.结论:体外培养20 d的视网膜水平细胞具备成熟的形态特征,免疫反应强度较强,是发育良好的神经元.
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大脑皮质星形胶质细胞体外条件化培养体系的建立
目的:建立大脑皮质星形胶质细胞体外条件化培养体系.方法:用快速灵敏的MTT比色法测定细胞活力,对纯化细胞进行形态学观察、免疫组化鉴定.结果:经分离、纯化,获得了纯的单一细胞群,星形细胞MTT测定的A值为0.255±0.012.结论:建立大脑皮质星形胶质细胞体外条件培养体系可以快速、高效得到纯度高的贴壁的星形细胞.
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人胎视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏
目的:冻存和复苏人胎视网膜色素上皮细胞,为视网膜色素上皮移植治疗视网膜色素变性提供组织来源.方法:取第3代胰酶消化法获取的人胎儿视网膜色素上皮细胞进行冻存,复苏后经台盼蓝染色测定细胞存活率,角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞.结果:复苏后的视网膜色素上皮细胞在体外生长良好,抗角蛋白反应阳性,细胞具有较高的存活率[(84.9%±3.2)%].结论:冻存和培养RPE细胞为细胞移植提供了一个良好的来源.
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大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养
目的:建立分离和培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的方法,观察大鼠MSCs(rMSCs)的生物学特性.方法:用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含10%限定性胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养,并传代扩增MSCs.结果:rMSCs是骨髓粘附细胞中形态均一的同源细胞群,组织化学结果显示rMSCsPAS-过碘酸雪夫氏染色阳性,苏丹黑-B及碱性磷酸酶染色阴性.结论:所建立的大鼠MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓粘附细胞中一组独特的同源细胞群,该细胞群有其特殊的代谢特点.
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人和小鼠内皮细胞的分离、培养及鉴定
目的:分离、培养并鉴定人和小鼠内皮细胞以建立稳定的细胞系,为研究肿瘤血管发生机制提供条件.方法:应用胰蛋白酶消化法,分别进行人脐静脉和小鼠肺组织内皮细胞的分离、培养及鉴定.结果:人、鼠原代培养的细胞接种后第2天即贴壁生长,第7天后长至汇合,细胞经八因子相关抗原染色,证实是内皮细胞.结论:胰蛋白酶消化法是一种简便可靠的分离、培养内皮细胞的方法.
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差速贴壁法分离培养早期人胚骨髓间充质干细胞
目的:探讨差速贴壁法从早期人胚股骨分离、纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行性,并观察培养细胞是否向神经元样细胞诱导分化.方法:取2～3月龄新鲜健康流产人胚股骨,切碎,接种玻璃培养瓶内培养8～12 h,待较多的成纤维细胞贴壁,立刻将未贴壁细胞转种至塑料培养瓶培养,并多次传代;用甲氧酚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)诱导培养的细胞,免疫细胞化学方法检测诱导后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况.结果:原代培养3 d可见塑料培养瓶内有长梭形细胞生长,至第10天前后形成集落样克隆,传至第4代后呈单层漩涡状排列的长梭形的成纤维样细胞,已无明显细胞克隆形成,经多次传代,细胞保持良好的增殖能力和稳定的性状;免疫细胞化学方法显示未诱导细胞NSE、Nestin、GFAP阴性,诱导后细胞NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性,间接证实培养所得细胞是MSCs.结论:差速贴壁培养法从早期人胚股骨中分离纯化MSCs,去除可能的成纤维细胞污染,是简便有效的,可供有关研究参考选择.
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人皮肤成纤维细胞原代培养方法的改良
目的:改良人皮肤成纤维细胞培养方法.方法:采用培养后组织块消化法(简称改良法)培养成纤维细胞,以组织块贴瓶法(简称贴瓶法)作为对照.结果:改良法成功率为100%,43 d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代;贴瓶法成功率为66.7%,47 d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代.结论:改良法是一种可行的成纤维细胞培养方法.
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连续外植块法培养SD大鼠成骨细胞及鉴定
目的 针对目前体外培养成骨细胞方法 的不足,探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法 .方法 采用SD大鼠胎鼠颅盖骨培养原代成骨细胞,并收集1～3次连续植块进行培养,观察细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化的变化.结果连续植块培养收集的1～3次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,细胞内碱性磷酸酶染色及矿化作用均无明显的区别.结论 连续植块法用于培养SD大鼠成骨细包具有简便、经济高效的特点.
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兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立
目的观察兔血管平滑肌细胞（VSMCS)在三维培养系统中的生物学特性. 方法在兔主动脉中膜来源的VSMCS单层培养系统的基础上，将VSMCS培养在胶原凝胶中，形成VSMCS三维培养系统. 并对细胞的形态结构、生长增殖及其影响因素进行研究. 结果①三维培养VSMCS在凝胶形成后3～4 h，形成多个细胞突起，呈星状. 后继续伸展，呈梭形、纺锤形. ②张力条件下，三维培养VSMCS可呈一定的方向性排列. ③三维培养VSMCS与经典的单层培养相比，细胞活力无统计学差异. 但细胞增殖受到一定程度的抑制. 结论运用VSMCS三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构、生长增殖等方面，还可研究在张力条件下的细胞生物学特征，对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.
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肺泡Ⅱ型细胞培养方法的改良及其应用
目的:研究不同方法对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响.方法:采用不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织,低密度接种,常规浓度含血清培养和无血清培养,抗大鼠IgG包被与不包被,倒置显微镜观察细胞生长,检测细胞活力,免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞.结果:两种方法消化、分离组织,肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异.结论:不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要,从而简化了体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序.
