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人干燥综合征B抗原的基因克隆及融合表达
目的:建立新的检测方法,克隆并表达人干燥综合征B抗原(SS-B). 方法:应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆SS-B全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)试验. 结果:PCR产物约为1 200 bp,与预期1 224 bp接近,测序结果与GenBank报道的完全一致.pGEX-5T- SS-B重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白相对分子质量为71 000,具有天然SS-B的免疫原性. 结论:成功克隆表达SS-B,为下一步研究奠定了基础.
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人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究
目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B(SS-B)抗原.方法:PCR扩增SS-B基因,与酵母菌表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SS-B.用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法鉴定.结果:PCR产物约为1 200bp,与预期1 224bp接近;pPIC9k-SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确.表达产物SS-B的相对分子质量约48 000,高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平,表达量占分泌总蛋白的60%以上,产物浓度为800～900mg/L.免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS-B分子的免疫原性.阴性对照菌未见目的表达条带.结论:SS-B在巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础.
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人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达
目的 克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren's syndrome antigen B, SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础.方法 根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5'非编码区和3'非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA.PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5a,构建重组质粒PET-30a-SSB.对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序.重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达.结果 RT-PCR扩增产物为1245bp.重组质粒PET-30a-SSB经EcoR I和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段.序列分析提示与GenBank中检索到的一致.SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性.结论 成功克隆SSB基因并表达融合蛋白.
