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人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究
目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B(SS-B)抗原.方法:PCR扩增SS-B基因,与酵母菌表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SS-B.用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法鉴定.结果:PCR产物约为1 200bp,与预期1 224bp接近;pPIC9k-SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确.表达产物SS-B的相对分子质量约48 000,高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平,表达量占分泌总蛋白的60%以上,产物浓度为800～900mg/L.免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS-B分子的免疫原性.阴性对照菌未见目的表达条带.结论:SS-B在巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础.
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蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因在毕赤酵母中的表达及活性分析
目的 利用毕赤酵母表达系统进行蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因的真核表达研究.方法 首先将蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子的重组基因的表达质粒pPIC9K / TAP经限制性内切酶SalⅠ酶切线性化后,电转化酵母菌株GS115感受态细胞, 并经MD平板与MM 平板、G418抗性筛选,PCR鉴定,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-TAP,经甲醇诱导分泌表达并对表达产物进行初步鉴定.结果 蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因在毕赤酵母中获得成功表达,表达产物有抗凝血因子活性和抗血小板的作用.结论 蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因在毕赤酵母中获得分泌性表达,表达产物显示抗凝血因子活性和抗血小板的作用.
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人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析
目的: 在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白.检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析.方法: 从人淋巴细胞中提取总RNA, 经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc, 然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc, 并将其插入pPIC9载体中.以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达.采用ELISA筛选高表达sTNFRII-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株, 对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构, 采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性, 后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链.结果: 成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株, 摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2 mg/L.SDS-PAGE和Western blot表明, 该融合蛋白能自然形成二聚体结构; 可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用, 其中和5×104 U/L TNF-α的EC50为170 μg/L.FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11 ～13个糖残基.结论: 在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白, 为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考.
