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抗乙型肝炎病毒药物筛选模型及其应用
乙型肝炎是一种严重危害人类的传染性疾病,全世界约有3.5亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者,中国就有1.2亿人之多.HBV感染是慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的主要诱因.研制抗HBV的药物是药学工作者的重要任务.研究HBV的实验模型近年来有了很大进展,从猩猩、树鼠句、鸭、转基因小鼠等动物模型到原代细胞、转染细胞等细胞模型.鸭、土拨鼠、转基因小鼠等动物模型已用于药物评价.
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基因组学在寻找新型抗生素中的应用
过去40年,抗生素药物主要局限于对一系列药物靶标有对抗作用的已知化合物的研究.这种方法不能产生足够的分子多样性,临床上抗药性问题日益严重.基因组学的发展增加了潜在的药物靶标,使简单直接的抗生素药物筛选转向合理的基于靶标的策略.基因组技术的应用,如表达图谱和蛋白质组,也将会大大推动药物的开发进程.
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噬菌体展示技术及其在药物筛选中的应用
噬菌体展示文库是目前广泛应用于生物医学领域的较为重要的分子工具,近年来相关研究进展迅速,目前该技术以具有库容量大、结合特异性强等特点而成为药物筛选的实用性工具.本文以噬菌体展示技术的原理为出发点,对噬菌体载体的分子生物学、噬菌体展示文库的构建和筛选及其在药物筛选中的应用进行了综述.
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基因芯片技术在药物研究中的应用
基因芯片技术是近几年发展起来的一项新技术,在生命科学研究中有着广泛的应用前景,它广泛应用于遗传作图、DNA测序、基因表达和基因诊断等领域,尤其在药物研究中有着重要的应用价值.本文就基因芯片技术在药物研究中的应用作一综述.
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药物筛选技术的研究进展
药物筛选是药物发现的主要手段之一，近年来在药物筛选的技术方面发展迅速。本文综述了药物筛选中药靶的发现、化合物样品的选择、超高通量药物筛选技术、高信息量筛选、药代动力学和毒性的高通量筛选、数据分析等方面的进展。
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一种用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物分子平台的建立
目的：建立用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物的分子平台。方法从人胎肝cDNA文库中分别扩增cereblon（CRBN）和Ikaros家族锌指蛋白1（Ikaros family zinc finger protein 1，IKZF1） cDNA，并将其克隆入pXJ40-myc和pcDNA3-FLAG载体中，将其转染293T细胞，通过检测沙利度胺及其衍生物对CRBN和IKZF1蛋白相互作用的改变，间接反映其在肿瘤抑制中的作用。结果 CRBN和IKZF1在293T细胞中均得到表达，沙利度胺及其两个衍生物可显著增强CRBN和IKZF1的结合。结论成功建立了用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物分子平台，初步发现2个沙利度胺衍生物可显著增强CRBN和IKZF1的结合，提示其具有潜在的抗癌活性。
关键词： 药物筛选 沙利度胺衍生物 CRBN Ikaros家族锌指蛋白 -
化学微阵列:一种药物筛选和发现的新工具
随着基因组和蛋白质组学研究发现大量药靶,高通量合成产生多种化合物库,基于微孔板的高通量筛选(HTS)技术面临着严峻挑战,迫切需要发展更为快速经济的新方法.化学微阵列技术应运而生.近年来研究证明,涉及不同表面化学与活化策略的化学微阵列技术,能成功地应用于评价化合物与蛋白质之间的相互作用、酶活性的抑制、靶的识别、信号通路机制的解析和基于细胞的功能分析之中.对于平行筛选作用于多靶的各种化合物库,该法显示了前所未有的潜力.
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校正新化合物在体筛选模型评价方法可降低假阳性
药物发现早期通常在啮齿类模型上进行在体药效实验,以优化筛选,迅速发现先导化合物,但当采用预先或同时给药方式进行时,常有过高估计新化合物疗效的可能.不利于科学决策、降低成本、时间安排及合乎伦理地使用动物.放弃预先给药方式,在模型动物上监测重要的生理参数及系统地应用简单药代-药效动力学分析可以减少假阳性结果.
关键词： 药物筛选 在体药效试验 药代-药效动力学分析 -
疾病特异性诱导多能干细胞:神经退行性疾病研究和临床治疗的有力工具
神经退行性疾病是一组由慢性进行性中枢神经系统退行性变性而产生的疾病总称.多数神经退行性疾病进展缓慢,发病机制不明,迄今仍无有效治疗措施.随着各种人类疾病特异性诱导多能干细胞(iPSC)的建立,利用患者自身细胞诱导形成的iPSC进行神经退行性疾病的研究更加切实可行.目前疾病特异性iPSC在神经退行性疾病模型建立、药物筛选及细胞移植等方面的研究取得了很大进展,对揭示神经退行性疾病的发病机制,并推动早期诊断及临床治疗的发展具有重要的理论意义和极大的应用潜力.本文重点介绍iPSC定向诱导神经细胞在帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和舞蹈病等5种常见神经退行性病中的建模、药物筛选及临床治疗方面的研究进展,同时对该领域当前面临的问题进行分析和评价.
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非核苷类逆转录酶抑制剂耐药型HIV-1药理评价体系的建立
建立9种临床常见的对非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse-transcriptase inhibitors,NNRTIs)耐药型HIV-1重组病毒药理评价模型.应用重叠PCR定点突变技术将耐药突变位点引入HIV-1核心基因(pNL4-3.Luc.R-E-),以水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G)包装含耐药突变位点的HIV-1核心,形成耐药型HIV-1重组假病毒颗粒,简称VSVG/HIV-mut(包括VSVG/HIV-wt、VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-Y181C、VSVG/HIV-L100I,K103N、VSVG/HIV.Y188L、VSVG/HIV-K103N,181C、VSVG/HIV-K103N,P225H、VSVG/HIV-K103N,Y188L、VSVG/HIV-K103N,G109A和VSVG/HIV-K103N,V1081).经验证9种NNRTIs耐药型HIV-1重组病毒颗粒均具有高感染能力,对核苷类阳性药物不耐药,而对非核苷类阳性药物呈现不同程度的耐药性(17～10 000倍),且耐药倍数与报道的数据基本一致.所建立的耐药型模型是针对NNRTIs耐药的HIV-1复制环节的细胞水平药效学评价体系,野生型和9种耐药型HIV-1模型的联合应用,可为新型非核苷类逆转录酶抑制剂的研发提供更全面药效学评价的安全平台.
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以雄激素受体为靶标的抗前列腺癌药物筛选模型的建立和应用
雄激素受体(AR)在维持前列腺的功能和促进前列腺癌形成的过程中发挥着非常重要的作用,也是前列腺癌药物治疗中的重要靶标.本研究通过构建AR活性依赖的双荧光素酶基因报告系统,在细胞水平上建立了以AR为靶点的抗前列腺癌药物筛选模型.并将该模型应用于传统中药红景天根、野生猕猴桃根、雷公藤根提取物的抗前列腺癌活性研究,为前列腺癌的治疗提供新的策略.
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家蚕作为人类疾病模型与用于药物筛选的研究进展及展望
家蚕(Bombyx mori)具有饲养容易、子代多、生命周期短、大小适中易于实验操作、遗传背景清楚、突变资源丰富等优点,长期被用作实验遗传学材料,被确定为鳞翅目昆虫的研究模式.家蚕也逐渐成为人类疾病模型和药物筛选的新型实验动物.近期的相关研究表明,在家蚕丰富的遗传资源中,存在着诸多人类遗传疾病模型,如苯丙酮尿症模型、帕金森病模型和海-普综合征模型等.家蚕在人类病原微生物致病机制探究方面也做出了重要贡献.此外,家蚕能够用于药代动力学研究及系统地评价药效及药物安全性,并且能够实现高通量药物筛选,可大大缩短新型药物的研发周期.本文综述了家蚕作为疾病模型及用于药物筛选的研究进展,分析了其开发前景,以期能够帮助人们全面地了解家蚕在新药研发中的作用,为大规模开展基于家蚕人类疾病模型的药物筛选提供参考.
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核磁共振用于蛋白质抑制剂的筛选和先导药物的发现
1 前言药物研制和开发的首要步骤是寻找和鉴定与生物靶分子高亲和力的配体化合物.目前高通量筛选方法已得到广泛应用.随着核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术和生物标记的发展,NMR技术已用于药物的筛选和设计领域.主要是NMR的参数众多,如化学位移、扩散系数、横向弛豫、NOE(转移NOE和NOE pumping[1]),这些参数都可用于配体化合物的筛选.另一特点是NMR能提供配体与靶蛋白结合的结构信息,有利于配体的设计.再是近代NMR技术的灵敏度提高和实验速度加快,结合组合化学的方法,每天能进行成千化合物的大规模筛选.本文着重介绍用1H/15N NMR化学位移法进行蛋白质抑制剂的筛选和先导药物的发现.
关键词： 核磁共振 异核单量子相关谱 1H/15N化学位移 蛋白质抑制剂 药物筛选 -
以RNA为靶标的药物筛选新技术
新药的开发有赖于新的筛选靶标和筛选模型的建立.传统上抗生素是以必需酶、受体、离子通道等为靶标进行筛选的.近年来,随着人类基因组和微生物基因组工作的进展,以RNA为靶标筛选新型抗生素的工作已越来越受到重视,rRNA、mRNA、病毒基因RNA和核酶等都可以作为药物筛选的靶标[1].目前研究较多的RNA靶标主要有两类,一类是细菌的16S rRNA,特别是其中的翻译解码区(A位点),该区段与核蛋白相互作用控制着翻译的进行;另一类是病毒的基因组RNA,特别是艾滋病毒(HIV)的TAR(trans-activator responsive)区段和RRE(Revresponse element)区段.TAR区段能与病毒编码的Tat(trans-activator)蛋白结合调节病毒基因组的复制;RRE区段能与Rev蛋白结合控制病毒的逆转录.本文对以RNA为靶标的药物筛选新技术作一综述,以期为有关研究工作者提供参考.
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应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂
建立以HIV-1复制为靶点的细胞水平假病毒药理筛选模型,并运用该模型筛选化合物库中随机选取的化合物.细胞水平的HIV-1假病毒药理筛选模型是应用水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G)包装HIV-1核心建立的,简称VSVG/HIV模型.细胞被VSVG/HIV感染后,病毒携带的报告基因的表达水平(荧光素酶活性或GFP阳性细胞比例)反映了HIV-1的复制水平.对HIV-1复制有抑制作用的化合物应用VSVG/MLV模型对其特异性地进一步检测.被感染细胞中报告基因的表达水平与病毒稀释度呈显著的剂量依赖效应.阳性药物齐多夫定(zidovudine,AZT)、拉米夫定(lamivudine,3TC)、去羟基苷(didanosine,DDI)可剂量依赖性地抑制HIV-1的复制,其IC50分别为48.5 nmol·L-1、 0.13 μmol·L-1和1.73 μmol·L-1,与文献报道一致.在随机筛选的500个化合物中有3个化合物可以抑制HIV-1的复制,IC50分别为1.92、 5.38和3.39 μmol·L-1,而对MLV的复制无影响.VSVG/HIV假病毒系统是一种安全、有效的针对HIV-1复制的药理筛选模型.当将此模型与VSVG/MLV模型联合使用时,可判断化合物作用的特异性.实验表明:3个化合物,2-甲硫基-5-(4-甲基苯并)酰胺基-1,3,4-噻二唑(化合物A)、N-(3-羟基苯基)-2-(4-异丁基苯基)丙酰胺(化合物B)和N-(4-甲基吡啶基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物C)可以特异性抑制HIV-1的复制.
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药物诱发性精神分裂症小鼠模型的建立与应用
根据精神分裂症患者认知混乱和情绪异常等症状,采用自发活动和前脉冲抑制(PPI)为评价指标,利用NMDA受体拮抗剂——地卓西平马来酸盐[(+)MK-801]为诱导剂,建立了药物致小鼠精神分裂症模型,并考察了阳性药氯氮平的干预作用.结果显示,给予MK-801可使小鼠自发活动显著增强,前脉冲抑制功能显著受损,预先给予氯氮平可显著改善两个指标的异常,使其恢复至与正常对照组无显著性差异.结果表明,所建立的评价模型可用于抗精神分裂症药物的快速筛选.
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筛选糖尿病候选药物FGF-21受体激动剂的新型细胞模型的建立
建立以成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growthfactor-21,FGF-21)信号通路为靶点的药物筛选细胞模型,用于筛选FGF-21受体激动剂类的新型治疗糖尿病药物.FGF-21的生理功能主要是通过细胞表面的FGFR及辅助受体βklotho传递信号,从而激活细胞内相关调控的一系列信号通路以及基因转录来实现的.本实验将βklotho基因构建到逆转录病毒表达载体pBMN-IRES-EGFP.将该载体导入包装细胞,收集病毒上清液并感染3T3-L1细胞,筛选到稳定表达βklotho细胞系.该细胞模型在FGF-21作用下可以促进细胞葡萄糖转运蛋白-1表达及转运水平升高,从而提高细胞糖吸收能力.构建该细胞系可以方便对FGF-21及类似药物进行高通量筛选,为糖尿病药物的研究提供了一种新方法.
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基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立
目的 建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型,以期发现ERβ亚型激动剂.方法 构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element,ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP,并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中,筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol,E2)诱导的阳性克隆.选取相关核受体配体进行模型的特异性考察,同时考察模型的稳定性及时效量效关系,以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况.利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选.结果 转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中,SEAP报告基因的表达受E2的诱导并呈剂量与时间依赖关系,E2对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z'因子值为0.7,免疫细胞化学染色结果表明,转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低.结论 利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂.
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鼠尾草属药用植物抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性初探
蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)是一个重要的胞内调节蛋白,通过催化胰岛素受体及胰岛素受体底物酪氨酸残基的去磷酸化对胰岛素信号转导起重要的负调控作用,近年的研究提示了PTP1B可能成为抗2型糖尿病药物研究的一个新靶点[1].基因敲除研究表明,PTP1B缺失小鼠具有正常表型且表现出显著增强的胰岛素敏感性,此外,PTP1B缺失小鼠对高脂饮食诱导的肥胖和甘油三酯水平升高具有明显的抗性[2].
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B 鼠尾草属 2型糖尿病 药物筛选 -
以莽草酸激酶为靶点的新型抗结核先导化合物的发现
莽草酸激酶是莽草酸途径中的关键蛋白,对结核分枝杆菌的生存至关重要.本研究首先建立了结核分枝杆菌莽草酸激酶 (Mycobacterium tuberculosis shikimate kinase, MtSK)抑制剂筛选模型,然后与耻垢分枝杆菌表型筛选方法联用,对12万个化合物进行筛选,终发现了1个对MtSK蛋白有抑制作用且同时抑制耻垢分枝杆菌生长的化合物—IMB-T5297 [(E)-3-(3-(3-氯-5-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙烯酰基)-6-甲基-2H-吡喃-2,4(3H)-二酮].体外酶促反应抑制实验表明,化合物IMB-T5297对MtSK的半数抑菌浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为1.745 μg·mL-1.表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)实验结果显示化合物 IMB-T5297与MtSK蛋白的亲和力KD值为2.151×10-5 mol·L-1.通过计算机软件模拟化合物与蛋白的分子对接模型,初步分析了化合物IMB-T5297与MtSK的作用位点,并对其中预测的5个关键氨基酸位点进行了突变研究.3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]实验表明,化合物IMB-T5297对哺乳动物细胞的毒性很低.体外抗结核活性实验表明,化合物IMB-T5297对结核分枝杆菌标准株H37Rv低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为49.723 μg·mL-1.综上所述,虽然化合物IMB-T5297的抗结核活性较弱,但对MtSK抑制作用较强,通过结构改造可能成为新的抗结核先导化合物.
