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高分辨率熔解曲线分析技术在鼠形动物鉴定中的应用
目的 探索一种能够快速鉴定常见鼠形动物的新型分子生物学方法.方法 以线粒体基因组(mtDNA)细胞色素b(Cytochrome b,Cytb)基因为靶基因,根据GenBank公布的序列,设计测序引物,扩增5种常见鼠形动物的目的基因并测序.依据测序结果和GenBank公布的序列,设计分析引物,进行高分辨率熔解曲线分析.以新鲜提取的基因组DNA为模板,按照1∶10的比例梯度稀释,检测7个浓度梯度,进行敏感性检测.结果 测序引物扩增出5种鼠形动物Cytb序列,分析引物扩增出5种鼠形动物的熔解曲线,并可根据曲线鉴别5种鼠形动物的种类,检测灵敏度为10-2 ng /μl.结论 利用高分辨率熔解曲线分析技术,可以快速准确鉴定5种常见鼠形动物.
关键词： 高分辨率熔解曲线分析 鼠形动物 Cytb基因 -
基于Cytb基因序列对入境集装箱中截获的疑似鼠样本的种类鉴定
目的 根据线粒体Cytb基因部分序列,对从入境集装箱中截获的疑似鼠样本进行鉴定种类.方法 提取样本中的DNA,采用PCR方法进行线粒体Cytb基因扩增,对目的片段测序,通过blast比对进行同源性比对.从Genbank获取宁波口岸常见8个鼠种24个样本的Cytb基因序列作为参照,利用生物信息学软件MegaS.0进行系统进化分析.结果 样本DXR1110与小家鼠同源性高,DXR1203与褐家鼠同源性高,系统进化树显示不同鼠种间形成独立分支.结论 Cytb基因分析是进行鼠种鉴定的有效手段.
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COI及cytb基因对河鲀鱼鱼种鉴定的适用性研究
目的 建立河鲀鱼DNA条形码鉴定方法,探讨细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)及细胞色素b(cytb)基因对我国常见东方鲀属、兔头鲀属河鲀鱼鱼种鉴定的适用性.方法 野捕河鲀鱼经形态学鉴定后,钓取COI及cytb基因序列并测序.从GenBank下载已有河鲀鱼参考序列,分别构建COI及cytb基因分子进化树,确定样品种属并与形态学鉴定比对.应用所建方法对中毒样品进行河鲀成分鉴定.结果 COI和cytb基因分子进化树将57份样品聚类到东方鲀属和兔头鲀属的9个鱼种,除棕斑兔头鲀和暗鳍兔头鲀(COI进化树)、暗纹东方鲀和晕环东方鲀(cytb 进化树)外,2种条形码均能对其余鱼种进行有效区分.中毒样品经鉴定均含有月兔头鲀.结论 所建立的DNA条形码方法可有效鉴定河鲀鱼鱼种,弥补形态学鉴定的缺陷.
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用Cytb基因序列分析鉴定肉制品掺假
目的 采用Cytb基因进行肉制品真伪鉴定的尝试性探索.方法 随机采集21份肉制品样品,首先采用CTAB法方法提取样品DNA,基于Cytb基因的通用引物对21份样品DNA进行PCR扩增,把扩增产物进行测序,然后采用DNAMAN软件进行序列的比对分析.结果 CTAB方法适合肉制品的DNA提取.10份牛肉样品中9份与标注吻合,1份检测出是猪肉;2份羊肉样品中1份与标注吻合,1份检测是猪肉;2份猪肉样品中1份与标注吻合,1份检测是鸡肉;1份鸡肉样品与标注吻合;6份牦牛肉样品中2份与标注吻合,4份检测是水牛肉.结论 用Cytb基因序列分析比对方法适合肉制品的真伪鉴定,市场上内制品存在掺假问题.
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广西、湖南、云南三地钉螺Cytb基因序列变异和系统进化研究
目的 分析广西钉螺与云南、湖南钉螺Cytb基因的遗传多态性和系统进化关系.方法 收集广西靖西、云南洱源和湖南岳阳三地钉螺,提取其基因组DNA, PCR法扩增线粒体Cytb基因并测序.用Clustal W(1.82)软件对所测得的Cytb基因序列进行排序,用MEGA3.1计算其碱基组成、转换及颠换;用Kimura双参数法计算遗传距离,用非加权组平均法(UPGMA)和大简约法(MP)构建系统发生树,同时结合三地钉螺分布和孳生地等资料进行分析.结果 PCR扩增获得Cytb基因大小为580bp.三地钉螺Cytb基因序列富含碱基A和T,A+T平均含量为61.2%,表现出较强的碱基组成偏倚.三地钉螺Cytb基因578bp的同源序列中检测到165个变异位点,约占核苷酸总数的28.5%.其中广西钉螺与湖南钉螺Cytb基因序列的变异位点为17个,约占2.94%;广西钉螺与云南钉螺Cytb基因序列的变异位点为160个,约占27.7%.广西钉螺与湖南、云南钉螺Cytb基因的遗传距离分别为0.031、0.405.采用两种方法构建的系统进化树均显示广西钉螺与湖南钉螺同属一个支系,云南钉螺单独形成另一支系.结论 广西钉螺与云南钉螺存在较大基因差异,进化速率较大,保守性较小,遗传距离较大,亲缘关系较远;广西钉螺与湖南钉螺基因差异较小,相对保守,进化速率不太大,遗传距离较小,亲缘关系较近.
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应用DNA条形码技术鉴定舟山群岛地区蝙蝠种类
目的 探索DNA条形码技术在蝙蝠种类鉴定中的应用.方法 本研究以舟山群岛地区3种常见蝙蝠标本为研究对象,提取基因组DNA,扩增CytB基因片段并测序,将测序结果进行BLAST比对分析;基于Kimura双参数模型计算22只蝙蝠CytB序列的种内种间遗传距离.结果 遗传进化分析显示种间遗传距离显著大于种内遗传距离,通过NJ法构建系统发育树聚类分析,不同种类的蝙蝠位于不同的分支,同属的蝙蝠分支较不同属的蝙蝠分支较短,种内分支则更短,上述结果都与形态学鉴定结果一致.结论 该研究建立的DNA条形码技术对于本研究中所涉及的蝙蝠种类具有较好的区分效果,可以作为一种有效的工具在蝙蝠鉴定中进行应用.
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江苏口岸常见鼠形动物Cytb基因分析
目的 通过基因分析,建立江苏口岸常见鼠形动物Cytb基因数据库和进化树,为口岸常见鼠形动物进行分子鉴定奠定基础.方法 通过基因扩增、构建质粒载体、测序等方法,建立江苏口岸常见鼠形动物Cytb基因数据库.结果 获得了褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠和大麝鼩等5种鼠形动物全长Cytb基因,并建立了5种鼠形动物Cytb基因进化树.结论 建立了江苏口岸常见鼠形动物Cytb基因数据库和进化树,为实现部分鼠形动物的分类鉴定奠定了基础.
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应用DNA条形码技术鉴定东南沿海蝙蝠种类
目的 探索DNA条形码技术在蝙蝠种类鉴定中的应用.方法 基于kimura双参数模型计算23只蝙蝠CytB序列的种内种间遗传距离.结果 种间遗传距离显著大于种内遗传距离,通过NJ法构建系统发育树聚类分析,不同种类的蝙蝠位于不同的分支,同属的蝙蝠分支较不同属的蝙蝠分支较短,种内分支则更短.种间遗传距离均在1.3以上,种内遗传距离均在0.21以下,与NCBI序列比对结果一致,与形态学鉴定结果一致(20只菲菊头蝠,1只马铁菊头蝠,1只大卫鼠耳蝠,1只小黄蝠).结论 DNA条形码技术对于本研究中所涉及的蝙蝠种类具有较好的区分效果,可以作为一种有效的工具在蝙蝠鉴定中进行应用.
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基于Cytb基因对药用昆虫地鳖虫炮制品的分子鉴别研究
目的:建立基于线粒体DNA细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的分子标记技术对地鳖虫(地鳖、冀地鳖)及其混伪品炮制药材进行分子鉴定的方法.方法:采用改良的饱和氯化钠法对地鳖虫及其混伪品炮制药材的总DNA进行提取.通过通用引物REVCB2H、REVCBJ对所有样品的Cytb基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增;用MEGA 5.1软件对所有样品的Cytb基因序列采用邻接(NJ)法构建系统发育树;并利用DNAMAN软件对得到的所有样品的Cytb基因序列进行比对,分析正品、混淆品间序列差异,在差异较大区域设计特异性引物Esin-F和Esin-R进行分子鉴定.结果:以提取的DNA为模板均能成功扩增出相应的Cytb基因片段;构建的系统发育树与其亲缘关系一致;设计的特异性引物Esin-F和Esin-R在同样的条件下,只有地鳖虫得到了扩增条带.结论:建立了地鳖虫及其混伪品药材炮制品的DNA提取方法;设计的特异性引物对地鳖虫有高度的特异性,能够有效鉴别地鳖虫及其混伪品.
