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宫颈液基细胞学样本中DAPK基因甲基化的检测及临床意义
目的:探讨在液基细胞学样本中检测宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变的DAPK基因的甲基化临床意义.方法:收集2014年6月～2015年6月在本单位就诊或体检妇女的宫颈液基细胞学检查样本231例,在满足细胞学诊断后,用甲基化特异性聚合酶链反应检测样本中DAPK基因的甲基化状态,同时做宫颈组织病理学检查.结果:总体样本中宫颈液基细胞学DAPK基因的甲基化率为16.9％(39/231),NILM、ASC-US、LISL、HISL、SCC各组中,DAPK基因的甲基化率分别为3.8％(2/53)、3.9％(2/52)、13.8％(8/58)、37.1％(23/62)、66.7％(4/6),HISL组和SCC组基因甲基化率高于NILM、ASC-US和LISL组.根据宫颈组织病理学诊断结果,宫颈炎、宫颈湿疣、宫颈上皮内瘤变(CIN)、鳞状细胞癌(SCC)各组中,DAPK基因的甲基化率分别为3.6％(2/55)、4.0％(2/50)、24.8％ (28/113)、53.9％(7/13),SCC组和CIN组DAPK基因甲基化率高于宫颈炎组和宫颈湿疣组;SCC组基因甲基化率高于CIN组.CINⅢ组DAPK基因甲基化率高于CIN Ⅰ及CINⅡ组,而CIN Ⅰ及CINⅡ组间无统计学差异.结论:宫颈液基细胞学样本中,SCC和HISL的DAPK基因的甲基化率相对较高,临床上可以利用少量液基细胞学检测样本,作为诊断宫颈癌及癌前病变的辅助诊断指标.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人HL-60细胞DAPK基因表达的影响
本研究旨在观察甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞株HL-60凋亡及死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因表达的影响,探讨5-aza-2dC治疗AML的作用机制.不同浓度的5-aza-2dC处理HL-60细胞后,采用瑞式染色法观察5-aza-2dC对HL-60细胞形态的影响,流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测5-aza-2dC对HL-60细胞DAPK基因表达的影响.结果表明,①5-aza-2dC呈浓度依赖性地促进HL-60细胞凋亡;②经5-aza-2dC处理后,HL-60细胞DAPK基因表达水平较处理前呈剂量依赖性地增加.结论:随着5-aza-2dC作用浓度的增加,HL-60细胞的凋亡率及DAPK基因表达水平均逐渐增加,提示DAPK基因可能是5-aza-2dC诱导HL-60细胞凋亡的调控基因之一.
关键词： HL-60细胞 5-杂氮-2'-脱氧胞苷 凋亡 DAPK基因 -
急性白血病死亡相关蛋白激酶基因表达及启动子区甲基化状态研究
本研究通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株的DNA甲基化及基因表达的实验,探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲基化的状态,并分析两者之间的相关程度.应用RT-PCR检测DAPK基因在白血病细胞及正常骨髓细胞中的表达;用巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)法检测急性白血病患者及细胞株DAPK基因启动子甲基化状况;从第二轮巢式MSP扩增出的随机产物中挑选2个随机引物,交予专业机构克隆后进行序列分析.结果表明:DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPKmRNA在急性白血病病人骨髓标本中表达平均值为0.61 ±0.40,低于正常对照者,差异有显著性(P＜0.05),其中52.94％(9/17例)的急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本DAPKmRNA表达降低或缺失,急性髓系白血病病人数据为41.18％ (42/102);细胞株U-937显示基因表达正常,HL-60表达缺失;102例急性髓系白血病病人骨髓标本中33例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为32.4％(33/102);17例急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本中8例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为47％ (8/17);7例正常人骨髓标本DAPK启动子区均为非甲基化;细胞株U-937 DAPK启动子区非甲基化,HL-60 DAPK启动子区甲基化.ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPKmRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关(ALL组r=-0.855,P＜0.05;AML组r=-0.343,P＜0.05),提示两者有密切的关联.结论:急性白血病患者中DAPK基因启动区甲基化与其mRNA的异常表达或失表达有关.
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基于p73和DAPK基因异常甲基化模式的白血病肿瘤标志物研究
目的 肿瘤抑制基因异常甲基化状态与白血病发生关系密切,发展白血病甲基化标志物成为研究热点.但白血病类型复杂,利用单个基因甲基化模式作为肿瘤标志物具有一定局限性.本研究通过探讨基于肿瘤抑制基因p73和死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase gene,DAPK)异常甲基化模式对白血病诊断分型的价值和意义,寻找一种联合多基因异常甲基化模式作为白血病肿瘤标志物的方法.方法 应用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP),分析正常人白细胞、单核细胞系白血病细胞株U937、粒细胞系HL-60及淋巴细胞系Jurkat基因组中,p73和DAPK基因启动子区CpG岛甲基化状态,将测序结果汇集到Office Excel 2010文件中,并计算各CpG位点甲基化率,绘制2个基因在4种细胞来源基因组中的CpG岛甲基化模式图,从而筛选特异甲基化位点组合.通过甲基化特异性PCR法(methylation specific PCR,MSP),在白血病细胞株、30例正常对照和104例白血病惠者外周血标本中,验证基因异常甲基化模式的诊断效能.结果 成功测序约107个含BSP产物转化质粒的菌株,并绘制出p73和DAPK基因CpG岛甲基化模式图.正常细胞基因组两者去甲基化程度远高于白血病细胞株.p73基因在正常细胞与白血病细胞株中,甲基化状态完全相反.DAPK基因在HL-60中与其他白血病细胞株甲基化状态存在明显差异.p73基因MSP甲基化检测可以鉴别正常细胞和白血病细胞,在临床白血病标本诊断中的灵敏度、特异度和准确度分别是21.5％、100.0％和43.1％,DAPK基因甲基化检测可以鉴别HL-60与其他白血病细胞株,其诊断急性非淋巴细胞白血病的灵敏度、特异度和准确性分别是59.1％、100.0％和77.2％.结论 p73和DAPK基因启动子区CpG岛在不同类型白血病细胞基因组中存在特异的甲基化位点,将其作为白血病初步诊断分型的潜在肿瘤标志物具有一定临床意义,也为今后发现白血病等肿瘤的甲基化标志物提供方法并奠定实验研究基础.
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多发性骨髓瘤患者DAPK的表达及启动子区甲基化状态的研究
目的：研究多发性骨髓瘤（ MM）患者抑癌基因DAPK的表达及其启动子区甲基化状态，探讨其在 MM发生发展中的作用。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术及实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）研究MM患者骨髓单个核细胞DAPK基因启动子甲基化发生率及其mRNA的表达水平。结果 MM患者DAPK基因启动子甲基化阳性率为18 B．52％，对照组中DAPK基因启动子区甲基化阳性率为0；MM组与对照组相比，差异有统计学意义（ P ＜0．05）。 MM组和对照组DAPK mRNA表达情况，差异无统计学意义（ P ＞0．05）；MM患者中甲基化组低于非甲基化组；甲基化组、非甲基化组与对照组比较，差异无统计学意义（ P ＞0．0167）；MM患者的初治组低于复发组，初治组、复发组与对照组比较，差异无统计学意义（ P ＞0．0167）。结论 DAPK基因启动子区甲基化可能是其mRNA表达的机制之一，并在MM的发病中具有一定的作用。
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胃癌中DAPK基因启动子区CpG岛高甲基化的研究
目的:探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因高甲基化与胃癌的发生以及临床病理特征之间的联系.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)法分别检测66例胃癌患者的肿瘤组织、癌旁正常组织、手术前外周血浆以及37例术后血浆中DAPK基因启动子的甲基化状况,以20例健康人的外周血浆和胃镜活检正常胃组织作为对照.结果:胃癌组织中有66.7%(44/66)存在DAPK基因的异常甲基化,显著高于相应的癌旁正常组织[10.6%(7/66)],差异有统计学意义(P<0.001).术前外周血浆中DAPK基因甲基化阳性率为16.7%(11/66);37例同时有胃癌根治术前后血浆标本的患者中,5例术前血浆甲基化阳性,术后全部转阴.而20例健康人的外周血浆和胃镜活检组织中均未检测到该基因甲基化. 结论:DAPK基因在胃癌患者肿瘤组织和外周血浆中的高甲基化可能为胃癌的诊断以及临床预后评估提供有益的线索,手术后血浆中DAPK甲基化状态的变化可能与手术治疗有关.
关键词： 胃肿瘤 DNA甲基化 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 DAPK基因 血浆 -
OPCML、DAPK基因甲基化与宫颈癌CasKi细胞凋亡相关性的研究
目的 研究天花粉蛋白(TCS)诱导宫颈癌CasKi细胞凋亡过程中肿瘤抑制基因OPCML、DAPK甲基化的变化情况,并探讨其在宫颈癌的发生发展中的作用及细胞凋亡和抑癌基因甲基化的相关性,寻找新型的去甲基化药物.方法 ①应用MTT法检测TCS对CasKi细胞增殖抑制的影响;流式细胞仪分析天花粉蛋白对宫颈癌CasKi细胞诱导凋亡作用;②应用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测人宫颈癌细胞OPCML和DAPK基因启动子CpG岛甲基化的状况及天花粉蛋白的去甲基化作用.结果 TCS对宫颈癌CasKi细胞生长有明显抑制作用,流式细胞仪检测见特征性的亚二倍体凋亡峰;MSP检测表明宫颈癌CasKi细胞OPCML、DAPK基因启动子区CpG岛呈高度的甲基化状态,TCS处理后OPCML、DAPK基因启动子区CpG岛无异常甲基化表现.结论 天花粉蛋白具有抑制宫颈癌CasKi细胞生长、诱导CasKi细胞凋亡和对CasKi细胞OPCML、DAPK基因明显的去甲基化作用;其抑制生长和诱导凋亡作用可能与对OPCML、DAPK基因的去甲基化作用有关.TCS有可能是一种新型的甲基化抑制剂.
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维甲酸受体-β基因和死亡相关蛋白激酶基因启动子区甲基化与食管鳞状细胞癌关系研究
目的 观察维甲酸受体-β(retinoic acid receptor β,RAR-β)基因、死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中启动子异常甲基化状况,探讨其在ESCC发生中的可能作用及早期诊断价值.方法 95例ESCC患者的癌组织(ESCC组)、癌旁组织(癌旁组)及正常组织(对照组),3组采用实时荧光定量甲基化特异性PCR法检测RAR-β及DAPK的甲基化状态.结果 ESCC组、癌旁组、对照组RAR-β基因启动子区CpG岛甲基化发生率分别为46.3％、26.3％和11.6％,DAPK基因启动子区CpG岛甲基化发生率分别为47.3％、22.1％和12.6％,ESCC组RAR-β基因和DAPK甲基化发生率高于癌旁组与对照组(P＜0.05);ESCC组RAR-β基因甲基化在年龄上差异有统计学意义(P＜0.05),RAR-β基因和DAPK基因甲基化在肿瘤位置、分化程度、转移及浸润深度上差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RAR-β和DAPK基因高度甲基化是ESCC组织的遗传学改变之一,可能参与了ESCC的发生、发展过程.
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大肠癌DAPK、FHIT基因启动子区的甲基化水平研究
目的:评价DAPK、FHIT基因启动子区甲基化状态在大肠癌发生发展中的作用和临床意义.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)检测23例大肠癌及相应癌旁正常组织的DAPK、FHIT基因启动子区甲基化状态.结果:大肠癌组织的DAPK、FHIT基因甲基化率分别为60.86％(14/23)、52.17％ (12/23),高于癌旁正常组织的13.04％(3/23)、8.69％(2/23),组间差异均有统计学意义(P＜0.05),DAPK、FHIT基因甲基化状态与分化程度、淋巴结转移有显著相关性(P＜0.05),与性别、年龄、肿瘤部位、Dukes分期无相关性(P＞0.05).结论:DAPK基因和FHIT基因启动子区的高甲基化可能与大肠癌的发生、发展、预后有关.
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原发性肝癌患者血清p16和DAPK基因启动子甲基化的研究
目的研究原发性肝癌患者血清p16和DAPK基因启动子甲基化的改变状况及其临床意义.方法运用甲基化特异性PCR技术,检测64例PLC患者血清p16基因和DAPK基因启动子甲基化,并分析与临床病理资料的关系.结果 PLC患者血清p16基因和DAPK基因甲基化检出率分别为76.6%(49/64)和40.6%(26/64),而正常对照组和良性肝部疾病组血清未检出p16基因和DAPK基因甲基化;p16基因和DAPK基因甲基化检出率与HBsAg、分期及转移状态无明显关系,而与AFP有关联.结论 p16基因和DAPK基因启动子异常甲基化参与了PLC的发生发展过程,并可作为PLC早期辅助诊断的分子标志物之一.
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诱导痰RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区甲基化在肺癌诊断中的价值
目的:探讨诱导痰中RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区异常甲基化及其联合检测在肺癌诊断中的价值.方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)技术,检测82例肺癌患者诱导痰和对应肿瘤组织以及25例肺部良性病变组织中RASSF1A, p16和DAPK 3种基因启动子区甲基化改变,并分析三者与临床病理资料的关系.结果:肺癌病理组织中RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区甲基化检出率分别为63.4%,59.8%和58.5%, 对应的诱导痰三者甲基化检出率分别为54.9%,48.8%和51.2%;肺部良性病变组织中甲基化检出率均为零,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).RASSF1A基因甲基化检出率在中高分化和无淋巴结转移的肺癌中明显低于低分化和未分化及有淋巴结转移者(P＜0.05),与年龄、性别、吸烟指数、临床分期及病理类型无关,而p16和DAPK基因甲基化检出率与上述因素均无明显相关性(P＞0.05);联合检测3种基因甲基化的检出率为73.2%.结论:联合检测诱导痰中RASSF1A, p16和DAPK基因启动子区高甲基化有可能作为诊断肺癌及评估预后的简便有效的指标,并能提高检出率.
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p16、DAPK和APC基因甲基化在肺癌早期诊断中的价值
目的 检测肺癌患者外周血中p16、死亡相关蛋白激酶(DAPK)和结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)基因启动子异常甲基化情况并分析其在肺癌早期诊断中的意义.方法 收集79例原发性肺癌患者(肺癌组)、40例肺良性病变患者(对照组)的外周血标本,应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测两组p16、DAPK和APC基因启动子的甲基化情况,并分析3个基因与肺癌患者的各项临床特征的关联情况.结果 肺癌组血清中p16、DAPK和APC的甲基化率分别为51.9％ (41/79)、50.6％ (40/79)、35.4％ (28/79),对照组中分别为2.5％ (1/40)、5.0％ (2/40)、2.5％ (1/40),两组比较差异均有统计学意义(P均＜0.05).p16、DAPK和APC基因甲基化单项鉴别肺癌的灵敏度分别为51.9％ (41/79)、50.6％ (40/79)、35.4％ (28/79).3种基因甲基化联合鉴别肺癌的灵敏度为73.4％ (58/79),高于单项指标.3个基因的甲基化与肺癌患者性别、年龄、吸烟史、组织学类型、肿瘤分期和淋巴结转移等多项临床资料均无相关性(P＞0.05).结论 外周血p16、DAPK和APC基因启动子甲基化与肺癌有关,联合检测p16、DAPK和APC基因甲基化可提高肺癌诊断的准确性.
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p16、DAPK和RARβ基因启动子CpG岛甲基化与非小细胞肺癌临床特征的关系
目的 研究非小细胞肺癌(non-smal celllung cancer,NSCLC)患者p16、DAPK和RARβ启动子区CpG岛甲基化对临床特征的影响,探讨其与吸烟的关系.方法 应用甲基化特异性PCR检测200例原发性NSCLC组织和相应正常组织中p16,DAPK和RARβ基因启动子区CpG岛甲基化状况.结果 p16、DAPK和RARβ基因甲基化在癌组织中的检出率分别为51.0%、60.0%和58.0%,均高于其在正常组织中的检出率(分别为12.5%,11.5%和15.0%;P＜0.05).非条件Logistic回归显示,癌组织p16基因甲基化与年龄和病例组织类型有关(P＜0.05);癌组织DAPK基因甲基化与年龄、性别、临床分类有关(P＜0.05);而癌组织RARβ基因甲基化与临床分类和TNM(tumor node metastasis)分期相关(P＜0.05).癌组织p16基因甲基化与DAPK基因甲基化之间存在交互作用(OR=1.987,95%CI:1.055～3.743).吸烟者癌组织p16和DAPK基因甲基化的OR值分别为3.139(95%CI:1.046～9.419)和3.585(95%CI:1.270～10.123),未发现癌组织RARβ基因甲基化与吸烟有关.结论 p16,DAPK和RARβ甲基化与NSCIC患者临床特征关系密切.吸烟与p16和DAPK基因甲基化有关.
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原发性肝癌患者血清DAPK基因启动子甲基化的分析
目的:分析原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)患者血清中DAPK启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义.方法:运用甲基化特异性PCR技术,检测64例PLC患者血清DAPK基因启动子区域甲基化的改变情况,并分析与临床病理资料的关系.结果:PLC患者血清DAPK基因甲基化检出率为40.6%(26/64),而正常对照组和良性肝部疾病组血清未检出DAPK基因甲基化,DAPK基因甲基化检出率与HBsAg、分期及转移状态无明显关系,而与AFP有关联.结论:DAPK基因检出启动子区域异常甲基化是PLC早期辅助诊断的分子标志物之一.
