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幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定
目的 构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(HUepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(HUepi-LTB),并对其进行纯化和鉴定.方法 采用PCR技术分别扩增HpaA-UreB表位多肽编码基因HUepi和LTB的编码基因LtB,重叠延伸PCR将2段基因拼接起来,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,经酶切鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用阳离子和阴离子交换层析进行纯化,PAGE检测、N端测序和western blotting、ELISA检测、GM1活性检测.结果 成功构建表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白的高效表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,重组工程菌pET-22b(+)-HUepi-LtB/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20.7×103,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达97 %,免疫学鉴定该融合蛋白与兔抗LTB抗血清可以发生特异性的结合.结论 Hp HpaA-UreB表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白(HUepi-LTB)经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性.为新一代Hp疫苗的研制奠定基础.
关键词： 幽门螺杆菌 黏附素 尿素酶B亚单位 大肠杆菌不耐热毒素B亚单位 -
幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究
目的获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位(HspA)的融合蛋白.方法 PCR扩增ltB和hspA基因,依次构建至表达载体pIM-1,转化大肠杆菌,SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况.采用GM1 ELISA和D(+)-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性.结果重组LTB-HspA融合蛋白表达量高可达细菌总蛋白的25%.免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白.GM1 ELISA和D(+)-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性.结论 LTB-HspA融合蛋白的表达研究,为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础.
关键词： 幽门螺杆菌 热休克蛋白A亚单位 大肠杆菌不耐热毒素B亚单位 融合蛋白 重组表达
