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颈髓损伤后GAP-43及内皮素mRNA表达与血脊髓屏障损害的研究
目的:为了探讨颈髓损伤后生长相关蛋白(GAP-43)mRNA及内皮素-1(ET-1)mRNA与血脊髓屏障损害的关系.方法:应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测颈髓损伤后颈髓组织GAP-43mRNA及ET-1mRNA表达.结果:伤后6～72h颈髓组织GAP-43 mRNA及ET-1 mRNA均较对照组明显增高(P＜0.01).结论:颈髓损伤后GAP-43 mRNA及ET-1 mRNA表达水平增加与伤后血脊髓屏障损害的发生、发展密切相关,生长相关蛋白、内皮素在颈髓损伤后血脊髓屏障损害的病理生理过程中起重要作用.
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bFGF促进大鼠血脊髓屏障的修复
目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 对脊髓损伤后大鼠血脊髓屏障的修复作用.方法 将大鼠随机分为假手术组、模型组、bFGF干预组(80 μg/kg).BBB法评价大鼠后肢运动功能后,于术后14 d处死;HE染色、NeuN染色观察脊髓损伤神经元丢失情况;伊文思蓝、FITC-dextran法检测血脊髓屏障的通透性;Western blot 检测黏附连接蛋白(p120-catenin和 β-catenin)和紧密连接蛋白(occludin 和claudin-5)表达.结果 术后3 d开始,bFGF干预组BBB 评分明显高于模型组(P<0.05);与模型组相比,术后3 d,bFGF干预组神经元丢失明显减少(P<0.05);术后1 d,bFGF干预组血脊髓屏障的通透性减少,p120-catenin、β-catenin、occludin 和claudin-5蛋白表达明显上升(P<0.05).结论 bFGF能够减少大鼠脊髓损伤后神经元的丢失,促进黏附连接蛋白和紧密连接蛋白的表达,促进血脊髓屏障的修复.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 脊髓损伤 黏附连接蛋白 紧密连接蛋白 血脊髓屏障 -
大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定
脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular endothelial cells,SCMECs)参与构成血脊髓屏障,其功能变化与多种脊髓相关疾病相关.目前分离SCMECs的文献很少.本研究拟基于分离多种原代内皮细胞的经验[1-2],建立分离纯化SCMECs的方法.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂:DMEM(高糖)、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型胶原蛋白酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和l×PBS(北京协和医学院细胞中心);牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胶原蛋白酶/分散酶(collagenase/dispase)(Roche公司);嘌呤霉素(Sigma公司);内皮细胞培养基(ECM)(Scien Cell公司);兔抗大鼠yon Willebrand factor(vWF)抗体(SantaCruz公司);抗GFAP抗体和抗α-SMA抗体(Abcam公司);FITC标记和TRITC标记的二抗(北京中衫金桥公司).
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小鼠脊髓损伤后基质金属蛋白酶-9及血脊髓屏障的变化
目的：探讨脊髓损伤后基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达变化对血脊髓屏障(BSCB)通透性的影响。方法 C57BL/6小鼠(n=68)随机分为假手术组、损伤后2 d组(S2)、损伤后7 d组(S7)和损伤后14 d组(S14)，每组17只。损伤组采用改良Allen's法制作中度脊髓损伤模型。在损伤后的第2、7、14天分别对小鼠进行盲法的小鼠后肢运动功能(BMS)评分和BMS亚评分；各组小鼠腹腔注入伊文思蓝，检测BSCB通透性；采用免疫荧光法检测紧密连接蛋白(occludin)表达，采用免疫印迹法检测occludin和MMP-9表达。结果术后2 d BMS评分显著降低，BSCB通透性显著增高；术后14 d BMS评分升高(P<0.01)，BSCB通透性下降(P<0.05)。术后7 d，occludin表达下调，MMP-9表达上调(P<0.05)；术后14 d occludin表达上调，MMP-9表达下调(P<0.05)。结论脊髓损伤后MMP-9可能通过介导occludin表达，影响BSCB通透性改变。
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脊髓缺血-再灌注损伤细胞间粘附分子-1及白细胞介素-1β的表达
目的:探讨脊髓缺血-再灌注损伤细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及白细胞介素-1β(IL-1)的表达对血脊髓屏障损害的分子机制.方法:将77只同龄Wistar大鼠,随机分为正常对照组、单纯缺血组和缺血再灌组.手术方法采用Zivin法复制模型.应用逆转录-聚合酶链反应、地高辛标记cDNA探针技术、免疫组化及免疫荧光激光共聚焦扫描显微镜技术检测脊髓再灌注损伤血管内皮ICAM-1 mRNA和IL-1β mRNA表达量.结果:正常组和单纯缺血组未引起细胞因子和粘附分子表达量的增加.而缺血再灌注后缺血区细胞因子、粘附分子的表达及多形核白细胞(PMN)的浸润先后发生了改变.再灌注2h,IL-1β mRNA的表达首先升高,约为对照组的2倍.再灌注6h达到高峰,并持续到12h.ICAM-1 mRNA表达量于再灌注4h明显升高,再灌注12h其在单位微血管面积上的荧光强度约比单纯缺血组增加了1/2.结论:再灌注损伤后脊髓微血管内皮ICAM-1及其调节因子IL-1β的表达量增加是导致血脊髓屏障损害的重要分子基础.
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大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障通透性变化的观察
目的:探讨脊髓损伤后血脊髓屏障通透性变化的机理.方法:采用美国纽约大学 (New York University,NYU)脊髓损伤模型,选用体重300～350克雄性成年Wistar大鼠35只,随机分为对照组5只;脊髓损伤组30只,分为伤后4、6、12、24、48、72h 6组,每组5只,应用NYU脊髓损伤模型,采用免疫组织化学方法,观察脊髓损伤后不同时间免疫球蛋白G(immunglobularprotein G,IgG)、补体3的C片断(c fragment of complement3,C3c) 的表达变化.结果:脊髓损伤后C3c、IgG渗入了脊髓损伤区域、损伤区域周边及血管,脊髓损伤不同时间段这些区域的免疫标记不同.结论:脊髓损伤后C3c、IgG参与了血脊髓屏障的破坏,参与了脊髓损伤后神经细胞的继发性损伤.
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创伤性脊髓损伤血管反应和继发性病理生理变化
大鼠脊髓的外部动脉主要由单一的脊髓腹动脉和成对的脊髓背动脉共3根纵行的动脉构成,并由根动脉补充供血;脊髓的内部动脉由中央动脉和微动脉组成;较大的前中央静脉和后中央静脉伴随供血动脉收集脊髓两侧的血液,但并不一定引流近的动脉供血区域.脊髓受到机械性创伤后,立刻引起表面血管的血管痉挛和实质内的出血,出血开始位于血管丰富且易受伤害的中央灰质.小胶质细胞、白细胞和星形胶质细胞参与了脊髓损伤后的炎症反应,与神经元继发死亡和脱髓鞘有关.脊髓损伤后血脊髓屏障通透性的改变使脊髓暴露于炎症细胞的毒性作用,而谷氨酸和甘氨酸等氨基酸类神经递质浓度过高时也对细胞产生毒性作用.
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连接蛋白43及相关通道在脊髓损伤中的作用的研究进展
连接蛋白43是广泛分布于中枢神经系统胶质细胞表面的四次跨膜蛋白,可在相邻细胞间以及细胞与外环境间形成直接物质交换通道——半通道和缝隙连接.脊髓损伤后,连接蛋白43的表达显著上调,同时细胞表面的半通道和缝隙连接大量开放,造成胞内代谢分子丢失以及胞外物质过量进入胞内,从而介导了损伤后的炎性反应、血脊髓屏障损伤以及神经元死亡等重要病理过程的发生发展,并在“二次损伤”中扮演重要角色.通过阻断剂或其他处理方法调节脊髓组织连接蛋白43的表达水平并抑制其相关通道开放后,对脊髓损伤有明显的改善作用.因此,连接蛋白43很可能是治疗脊髓损伤的新靶点,本文将对连接蛋白43介导脊髓损伤的相关机制以及基于连接蛋白43的脊髓损伤治疗方法作一综述.
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多功能阳离子脂质体跨血脊髓屏障的实验研究
目的：探讨异硫氰酸荧光素(FITC）标记阳离子脂质体通过尾静脉注入后，跨越大鼠血脊髓屏障并在局部聚集的情况。方法30只成年Wistar大鼠随机等分为3组，每组10只，荧光显微镜动态观察脂质体在中枢神经系统(CNS）中靶向聚集与扩散情况，通过组织学观测进一步分析其与CNS细胞的关系。结果相同浓度下(75~600μg/mL），TAT-PEG-阳离子脂质体较未经TAT修饰者具更低细胞毒性，且更易被MCF-7细胞摄取；FITC标记TAT-PEG-阳离子脂质体可跨越BSCB并聚集，低倍镜下观察到许多荧光微粒聚集于CNS组织，高倍镜形象地显示出荧光微粒位于神经细胞内。结论经跨膜肽(TAT）、聚乙二醇(PEG）修饰的阳离子脂质体具有良好的生物相容性与靶向定位特性，可跨过BSCB，聚集于CNS细胞中，安全用作药物载体，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的途径。
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CB1大麻素受体激动剂抑制基质金属蛋白酶参与脊髓损伤后血-脊髓屏障通透性调节
目的：探讨CB1大麻素受体激动剂在大鼠脊髓损伤后对血-脊髓屏障通透性调节的作用。方法将150只雌性SD大鼠随机分为假手术组( Sham组)、脊髓损伤组( SCI组)和CB1激动剂处理组( ACEA组)。采用改良Allen法建立T9脊髓损伤实验动物模型。 Sham组仅行T9椎板切除术,SCI组和ACEA组以30 g·cm致伤力制作模型。 ACEA组建模成功后,每日腹腔给药ACEA 3mg/(kg·d)；Sham组和SCI组以生理盐水代替。建模术后12、24、72 h分时段处死动物,取T8~T10脊髓节段,Evans蓝含量测定法检测SCI后血-脊髓屏障通透性变化,定量RT-PCR法检测脊髓组织基质金属蛋白酶9(MMP9)表达水平。结果 Sham组脊髓通透性无改变,脊髓组织中无Evans蓝渗入,ACEA组Evans蓝通过血-脊髓屏障渗漏至脊髓,但渗漏量明显低于SCI组。 ACEA组MMP9表达水平显著低于Sci组。结论 CB1受体激动剂ACEA能降低Allen′s大鼠脊髓损伤模型血-脊髓屏障的破坏,其作用机制可能与MMP9的表达下调相关。
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脊髓损伤后血脊髓屏障病变机制研究进展
脊髓损伤常会遗留神经系统后遗症,甚至导致患者瘫痪,其病理过程包括原发性损伤和继发性损伤. 继发性损伤是引起脊髓病变的主要原因,往往导致脊髓无法恢复正常功能,而继发性损伤与血脊髓屏障形态与功能的异常变化密切相关. 通过回顾近些年关于血脊髓屏障的基础试验研究,对脊髓损伤后血脊髓屏障的病理变化及发病机制进行综述.
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Tamoxifen对大鼠脊髓损伤后炎症反应的影响
IL-1β的产生有所减少,BSCB的破坏也得到明显改善(均P<0.05).结论:Tamoxifen可以减轻大鼠SCI后炎症反应,促进血脊髓屏障的恢复.
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脊髓损伤后EGFR信号通路激活介导血脊髓屏障破坏机制的研究进展
脊髓损伤(SCI)与血脊髓屏障(BSCB)破坏密切相关,而表皮生长因子受体(EGFR)过度活化在BSCB破坏及SCI发生发展中起着关键性作用.本文围绕EGFR信号通路激活介导SCI后BSCB破坏机制的新研究进展进行综述.
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电针预处理对脊髓缺血再灌注损伤后血脊髓屏障的影响
目的 研究电针预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后血脊髓屏障的影响.方法 SD大鼠90只,随机分为3组,每组30只:假手术组(S组)、脊髓缺血再灌注损伤组(IR组)、电针预处理组(E组).IR组和E组大鼠阻断胸主动脉造成缺血再灌注损伤模型,S组只开胸暴露胸主动脉但不阻断,E组在夹闭胸主动脉前行电针刺激预处理.观察记录术后48 h大鼠神经运动功能评分,依文思兰荧光法测定血脊髓屏障通透性,Western blot检测脊髓组织中AQP-4表达情况.结果 与S组比较,IR组神经功能评分明显降低,血脊髓屏障通透性明显增加,AQP-4表达明显增多(P<0.05).与IR组比较,E组神经功能评分增高,血脊髓通透性降低,AQP-4表达减少(P<0.05).结论 电针预处理可以明显抑制脊髓缺血再灌注损伤后AQP-4的表达,降低血脊髓屏障通透性,进而减轻脊髓缺血再灌注损伤.
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丙泊酚对兔脊髓缺血再灌注损伤血脊髓屏障的保护作用
目的：探讨丙泊酚对兔脊髓缺血再灌注损伤血脊髓屏障的保护作用。方法：72只日本大耳白兔随机分为3组：假手术组（Sham）、模型组（I／R）、丙泊酚组（I／R ＋ P）。 I／R和I／R＋P组阻断腹主动脉30 min。I／R ＋ P组于主动脉阻断前10 min和再灌注即刻泵注丙泊酚，另两组泵注生理盐水。再灌注24、48 h行神经功能评分，EB检测血脊髓屏障的通透性，Western blot，RT-PCR检测MMP-9、claudin-5、NF-κB表达，HE染色观察形态变化。结果：与Sham组相比，I／R组神经功能评分降低，屏障通透性增加，MMP-9、NF-κB表达增多， claudin-5表达减少（P＜0．05）；与I／R组相比，I／R＋P组神经功能评分增高，屏障通透性降低，MMP-9、NF-κB表达减少，claudin-5表达增多（P ＜0．05）。结论：丙泊酚对兔脊髓缺血再灌注损伤血脊髓屏障具有保护作用，其保护机制可能与抑制NF-κB信号通路，抑制MMP-9的表达，减少claudin-5的丢失有关。
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脊髓缺血再灌注损伤与血脊髓屏障关系的研究进展
脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI）是许多病理生理情况下的并发症，如胸腹主动脉瘤以及脊椎手术［1］。在胸腹主动脉瘤及脊柱手术时为了减少术中出血，便于手术操作，常常需要阻断主动脉一段时间，再开放时往往会引起脊髓组织损伤，甚至导致截瘫。 SCIRI不仅给患者造成了严重的生理和心理伤害，而且给其家庭及社会造成了沉重的经济负担。虽然缺血预处理、低温处理、药物干预等治疗措施取得了一定的疗效，但SCIRI引发的截瘫仍对患者有着严重的威胁［2］。有效地防治SCIRI仍是临床上亟需解决问题。血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）对维持神经系统内环境的稳定发挥着至关重要的作用。近来研究［3－4］发现BSCB在SCIRI中起着极其重要的作用，保护BSCB 的完整可以减轻 SCIRI 及其降低截瘫的发生，为防治SCIRI提供了一个新的治疗方向。
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中分子量羟乙基淀粉对脊髓损伤后神经病理性疼痛的影响
目的 研究中分子量羟乙基淀粉对脊髓损伤后损伤平面以下神经病理性疼痛的影响.方法 SD大鼠72只,采用随机数字法,分为4组,3组建大鼠脊髓(T10-11)中度撞击伤模型并经尾静脉分别给予生理盐水、低分子量羟乙基淀粉、中分子量羟乙基淀粉,余下1组仅去除相应椎板.行为学观察大鼠痛阈变化.术后测脊髓组织内伊文氏蓝含量,观察血脊髓屏障变化,Western blot观察胶质细胞活化情况,ELISA定量IL-1、IL-6、TNF-α表达水平.结果 大鼠脊髓损伤后3d脊髓组织伊文氏蓝含量测定示(生理盐水组:2.58 ±0.30;低分子量羟乙基淀粉组:2.38±0.48,中分子量羟乙基淀粉组:1.38±0.35)中分子量羟乙基淀粉组较生理盐水组和低分子量羟乙基淀粉组能有效缓解血脊髓屏障的异常开放(P＜0.05)；脊髓损伤后10 d神经胶质细胞形态学观察,中分子量羟乙基淀粉组较另2组可显著减轻损伤区巨噬细胞/小胶质细胞活化程度,并可降低损伤段脊髓组织IL-1、IL-6、TNF-α表达水平(P＜0.05)；术后10 d大鼠行为学观察,各手术组所测机械痛敏压力阈值较术前明显降低,中分子量羟乙基淀粉组较生理盐水组和低分子量羟乙基淀粉组治疗可使痛阈升高(P＜0.05).结论 中分子量羟乙基淀粉可能通过挽救通透性异常的血脊髓屏障,抑制损伤区域巨噬细胞/小胶质细胞的活化而缓解大鼠脊髓损伤后神经病理性疼痛.
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缺氧损伤后血红素加氧酶1截短体(HO-1C△23)上调miR-125a-5p降低血脊髓屏障的通透性
目的 检测微小RNA 125a-5p(miR-125a-5p)在血红素加氧酶1截短体(HO-1C△23)调节缺氧损伤时血脊髓屏障(BSCB)中的作用.方法 用HCMEC/D3细胞与星形胶质细胞在TranswellTM小室构建体外BSCB模型,并用氯化钴制备BSCB缺氧模型.实验分为空白组、空载病毒组、HO-1C△23组(Lv-HO-1C△23)、miRNA阴性对照组(Lv-HO-1C△23联合miR-NC处理)、miRNA模拟物组(Lv-HO-1C△23联合miR-125a-5p mimics处理)和miRNA抑制物组(Lv-HO-1C△23联合miR-125a-5p inhibitor).用反转录PCR和实时定量PCR检测各组miR-125a-5p和紧密连接蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)和血管内皮钙黏附蛋白(VE-cadherin)的mRNA水平,Western blot法检测各组HO-1、ZO-1和occludin、VE-cadherin的蛋白水平;用辣根过氧化物酶(HRP)的溢出率评价体外BSCB的通透性.结果 HO-1C△23转染HCMEC/D3细胞的成功率约为70％,转染成功后HO-1C△23含量明显升高,且miR-125a-5p表达较空白组也明显上调.与空白组相比较,HO-1C△23组、miRNA阴性对照组和模拟物组ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平增加,HRP溢出率降低,而miRNA抑制物组中ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平降低,HRP溢出率升高;与HO-1C△23组相比,miRNA模拟物组ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平明显升高,HRP溢出率降低,而miRNA抑制物组ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平降低,HRP溢出率升高.结论 在缺氧损伤条件下,HO-1C△23通过上调miR-125a-5p表达,促进连接与黏附相关基因的转录与翻译,降低BSCB的通透性.
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脂肪干细胞移植治疗脊髓损伤研究进展
脊髓损伤( spinal cord injury,SCI)由于其损伤位置的特殊性,常导致损伤平面以下肢体不可逆的神经功能丧失,造成截瘫、四肢瘫等严重的并发症,给工作和生活带来毁灭性的打击,同时,也为社会带来沉重的经济负担[1]. 目前,我国经济的不断发展,机动车事故、跌倒以及暴力行为等造成的SCI患者不断增加,而治疗却仅限于早期使用大剂量类固醇和急性外科干预,以尽量减少脊髓水肿和随后的继发性或迟发性损伤[2-4]. 因此,寻找治疗SCI的有效手段已经成为现代医学工作者需要面对的一大难题.
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脊髓缺血-再灌注损伤细胞间粘附分子ICAM-1及其调节因子IL-1β的表达对血脊髓屏障损害的分子机理
目的:深入探讨脊髓缺血-再灌注损伤细胞间粘附分子-1及其调节因子白细胞介素-1β的表达对血脊髓屏障损害分子机制.方法:采用逆转录-聚合酶链反应、地高辛标记cDNA探针技术、免疫组化及免疫荧光激光共聚焦扫描显微镜技术检测脊髓再灌注损伤血管内皮ICAM-1mRNA和IL/1βmRNA表达量.结果:正常组和单纯缺血组不引起细胞因子和粘附分子表达量的增加.而再灌注后缺血区细胞因子、粘附分子的表达及PMN的浸润先后发生了改变.再灌注2h,IL-1βmRNA的表达首先升高,约为对照组的2倍.再灌注4h明显升高,6h达到高峰,并持续到12h.ICAM-1 mRNA表达量于再灌注4h明显升高,再灌注12h其在单位微血管面积上的荧光强度约比单纯缺血组增加了二分之一,再灌注12h脊髓组织中MPO活性约为单纯缺血组的两倍.结论:再灌注损伤后脊髓微血管内皮ICAM-1及其调节因子IL-1β的表达量增加是导致血脊髓屏障损害的重要分子基础.
