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穿膜肽-抗体-微球偶联物的制备方法研究
目的:探讨制备穿膜肽-抗体-微球新型药物传送系统的可行性.方法:采用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)交联法将穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白(CPPs-EGFP)、牛血清白蛋白微球(BSA-NS)、乙肝高效价免疫球蛋白(HBIg)分别采用一次偶联法和二次偶联法两种交联方案进行共价交联,采用还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫荧光法评价穿膜肽、抗体、微球间的交联.结果:两种交联方案制备的穿膜肽-抗体-微球偶联物,SDS-PAGE还原电泳均可见在低分子量端形成三条蛋白条带,非还原电泳均未见条带;在不同激发波长的荧光显微镜下,均可见微球表面分别发出绿色荧光和红色荧光.结论:应用SP-DP交联剂,无论是一次偶联法还是二次偶联法均能够将穿膜肤、抗体、微球有效地进行偶联,为进一步研究穿膜肤-抗体-微球新型药物传送系统的特性奠定了基础.
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牛血清白蛋白作为生物医用材料产品体液免疫评价阳性对照物的研究
目的本文旨在对生物医用材料免疫原性评价方法进行初步探索,寻找有效的生物医用材料产品体液免疫评价所需阳性对照物,并对其使用剂量,免疫方法和免疫效果进行探索,为生物医用材料产品免疫原性评价实现标准化积累数据.方法选取雌性8周Balb/c小鼠,随机分组,分别不同剂量免疫3次,每次间隔两周.分别摘眼球取血,分离血清,并进行血清抗体总IgG浓度检测,实验结果利用统计学方法进行分析.结果牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)单独免疫小鼠均无显著的体液免疫刺激作用;BSA混合佐剂免疫小鼠中剂量组和高剂量组的淋巴细胞增值能力明显强于阴性对照组,高剂量组强于中剂量组;二次免疫后两周取材与3次免疫后两周取材BSA混合佐剂组细胞增殖能力均与阴性对照组有显著性差异,3次免疫后两周强于二次免疫后两周,佐剂对照组与阴性对照组淋巴细胞增值能力无显著性差异.结论实验证明,BSA可以作为生物医用材料产品体液免疫检测的阳性对照物,免疫刺激强度适中.
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免疫避孕用含模型蛋白的新型可生物降解聚酯微球的研究
目的:考察新型可生物降解聚酯材料聚(5-羟基三亚甲基碳酸酯-co-三亚甲基碳酸酯)P(HTMC-co-TMC)作为口服免疫避孕疫苗载体的可行性.方法:以BSA为模型蛋白,采用改进的复乳溶剂蒸发法制备含BSA的微球,表征微球的性能参数及其体外释放行为.结果:微球表面光滑,粒径均一,分布较窄,不同共聚组成聚合物的释放速率不同.结论:可通过调节新型可生物降解聚酯的共聚组成调节BSA的释放速率,该类新型可生物降解聚酯有望成为口服避孕疫苗的控制释放载体.
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不同方法检测二氧化氯杀菌效果及影响因素的比较
比较载体定量法与悬液定量法对检测二氧化氯消毒剂杀菌效果的区别,在实验室进行了观察.结果,用载体定量杀菌试验,以含200 mg/L二氧化氯消毒剂溶液对大肠杆菌作用3 min ,杀灭对数值均>3.0.用悬液定量杀菌试验,以含3 mg/L二氧化氯消毒剂溶液对大肠杆菌作用1 min ,杀灭对数值均>5.0.菌悬液中加3%牛血清白蛋白,对大肠杆菌杀灭对数值达到5.0以上,需要30 mg/L二氧化氯作用3 min .菌悬液中加0.3%牛血清白蛋白对杀灭大肠杆菌效果无影响.结论,载体定量法测得的二氧化氯杀菌剂量明显高于悬液定量法, 3%小牛血清白蛋白对杀菌效果有明显影响.
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比较两种有机物对消毒剂杀菌效果评价的影响
为比较两版"规范"规定的有机物对评价消毒剂杀菌效果的影响,采用悬液定量杀菌试验,对小牛血清与小牛血清白蛋白的影响进行了比较试验.结果,按第三版"规范"试验确定的消毒剂低有效浓度即有效氯使用50 mg/L,菌悬液含50%和25%小牛血清,有机物试验只有第4作用时间所试微生物杀灭效果均合格,有机物对三氯异氰尿酸杀菌效果影响明显.按2002年版"规范"试验确定的低有效浓度即有效氯使用200 mg/L,菌悬液含50%和25%小牛血清,第1～4作用时间的试验对所试微生物杀灭效果均合格,有机物对三氯异氰尿酸杀菌效果无影响.结论,两版"规范"试验确定的同一消毒剂低有效浓度不同,有机物影响试验结果差异明显.
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有机物对优氯净杀菌效果影响的实验研究
以低有效浓度及短有效时间为试验剂量,采用悬液定量杀菌试验,对两种有机物影响二氯异氰尿酸钠杀菌效果进行比较观察.结果,含体积分数50%小牛血清与1.5%小牛血清白蛋白对二氯异氰尿酸钠杀菌效果的影响无明显差别.与不含有机干扰物组比较,50%小牛血清和1.5%白蛋白对二氯异氰尿酸钠杀菌效果均有轻度影响.结论,所试验的两种有机物对二氯异氰尿酸钠杀菌效果的影响无明显差别.
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荧光猝灭法研究大黄酚与牛血清白蛋白的相互作用
目的:运用荧光猝灭光谱研究了模拟人体生理条件下大黄酚与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.方法:以BSA为荧光剂,大黄酚为荧光猝灭剂,在激发波长278 nm下的荧光光谱,根据Stern-Volmer方程、位点结合模型和Lineweawer-Burk双倒数曲线方程,求出了大黄酚与BSA结合的结合类型、结合位点数和结合常数等参数.并利用Van't Hoff方程求得反应的热力学参数,讨论了大黄酚与蛋白质的主要作用力类型.结果:大黄酚与BSA形成复合物从而猝灭BSA的内源荧光,且其荧光猝灭机理符合静态机制.在25℃和37℃下大黄酚与BSA结合的结合常数分别为:4.923×104 L·mol-1和5.928×104 L·mol-1；结合分子数分别为:0.8551和1.0583.热力学数据表明大黄酚与BSA以疏水作用为主,同时也存在较弱的静电作用.结论:大黄酚在体内能够被血清白蛋白存储和转运,且结合时可能改变了BSA的构象.
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光谱法研究炎琥宁与牛血清白蛋白的相互作用＊
目的：研究炎琥宁（YHN）与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用，为后续琥宁类药物的研发和进一步探讨炎琥宁在生物体内与蛋白质的作用机制提供理论依据。方法：在优化的实验条件下，运用荧光猝灭光谱法、紫外光谱法和同步荧光光谱研究炎琥宁与BSA的相互作用。283.15 K、298.15 K和313.15 K温度下，根据 S-V方程计算出猝灭常数（KSV）和速率常数（Kq）；根据L-B双倒数方程计算出静态猝灭结合常数（KLB）；根据双对数方程计算出结合常数（Kb）和结合位点数（n）；根据热力学公式计算出焓变（ΔH）、熵变（ΔS）和吉布斯自由能变（ΔG）；根据Hill方程计算出 Hill系数（nH）。结果：3个温度下的BSA荧光强度随着炎琥宁浓度升高，有规律地降低；KSV、Kq、KLB、Kb、n和nH值随着温度升高而降低；ΔG<0，ΔH<0，ΔS<0；n约等于1；nH大于1。结论：炎琥宁与BSA形成基态复合物从而猝灭BSA的内源性荧光，猝灭机理为静态猝灭。通过计算反应热力学参数值，可推断炎琥宁与BSA作用力主要为氢键和范德华力。炎琥宁与BSA可形成一个结合位点，表明炎琥宁与BSA之间具有一定的结合作用，炎琥宁在体内可被蛋白质储存和转运。生成自由能变ΔG为负值，表明炎琥宁与BSA的作用过程是一个自发过程。nH大于1，表明炎琥宁有正协同作用。两者的结合部位主要位于亚螺旋域ⅡA中。同步荧光光谱表明炎琥宁对BSA构象产生一定的影响，使BSA腔内疏水环境的极性减弱，结合位点更接近于酪氨酸。
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黄芪总皂苷提取物对牛血清白蛋白致大鼠肝纤维化作用的影响
目的:观察黄芪总皂苷提取物对牛血清白蛋白(BSA)致大鼠实验性肝纤维化作用的影响.方法:将60只SD大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、秋水仙碱组(C组)、黄芪总皂苷提取物低剂量组(D组)、黄芪总皂苷提取物中剂量组(E组)、黄芪总皂苷提取物高剂量组(F组),每组10只.采用皮下多点注射牛血清白蛋白(BSA)免疫性诱导大鼠肝纤维化进行造模.造模后,C～F组分别按0.1 mg·kg-1·d-1,15,30,60 mg·kg-1 ·d-1剂量ig给药.55 d后,分别检测血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)及Ⅳ型胶原(Ⅳ-c)的含量,并对肝组织进行病理学观察.结果:黄芪总皂苷提取物可使BSA免疫性诱导的肝组织纤维增生、变性和坏死明显减轻.黄芪总皂苷提取物各组大鼠血清ALT,AST,HA,LN,PC-Ⅲ,Ⅳ-C及肝组织羟脯氨酸含量与模型组比较均显著降低(P＜0.05,P＜0.01).病理组织学观测结果显示,黄芪总皂苷各剂量组与模型组比较均有不同程度改善.结论:黄芪总皂苷对BSA所致实验性大鼠肝纤维化具有良好的治疗作用.
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荧光光谱法测定黄芪甲苷及环黄芪醇与牛血清白蛋白相互作用
目的:采用荧光光谱法研究黄芪甲苷及环黄芪醇与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用机制.方法:固定BSA浓度,依次加入不同浓度的黄芪甲苷或环黄芪醇,扫描其荧光猝灭光谱及同步荧光光谱.结果:黄芪甲苷和环黄芪醇均能对BSA的荧光发生淬灭,猝灭类型属于静态猝灭;在293 K下,黄芪甲苷和环黄芪醇与BSA的结合常数分别为1.35×104,8.51×104 L·mol-1,结合位点数n分别为0.726 4,0.731 2,在310 K温度下,二者与BSA的结合常数均略有下降.二者与BSA的结合过程均属于焓变小于零、熵变大于零、吉布斯自由能小于零的自发过程,与BSA的作用力类型为静电作用为主.同步荧光光谱显示二者均对色氨酸残基构象产生影响,对酪氨酸残基构象影响较小.结论:本实验阐明了黄芪甲苷和环黄芪醇与牛血清白蛋白的作用机制,为其进一步用药提供了理论依据.
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盐酸青藤碱牛血清白蛋白微球的研究
目的:制备具有缓释作用的盐酸青藤碱牛血清白蛋白微球.方法:采用喷雾干燥法制备盐酸青藤碱牛血清白蛋白微球,并对其形态学性质、载药量及体外释药进行考察.结果:通过优化工艺,制得的微球粒径分布范围为1～3 μm,当改变药物与囊材的比例为1∶2,1∶1和2∶1时,获得的微球载药量分别为31.6%,47.7%和67.9%,药物包封率均大于94%.体外释放试验表明,该制品较原注射剂具有明显缓释作用,且通过调整处方组成及热变性条件可获得不同释药特性的微球.结论:喷雾干燥法是一种简单易行的白蛋白微球的制备方法.制得的微球载药量高,具有明显缓释作用.
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光谱法和分子对接研究哈巴俄苷与牛血清白蛋白的相互作用机制
综合利用二维和三维荧光光谱、同步荧光光谱、紫外光谱以及分子模拟等方法,研究了哈巴俄苷(harpagoside,HAR)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的相互作用机制.结果表明,HAR有规律的使BSA内源荧光猝灭,猝灭机制属于静态猝灭;两者结合常数KA均大于1×105 L·mol-1,结合位点数n接近于1.由HAR与BSA相互作用的热力学参数△G,△H和△S均小于0可知,两者结合过程是自发进行的,结合的主要作用力是氢键和范德华力.根据F(o)rster非辐射转移理论,计算了不同条件下HAR与BSA的结合距离r为2.80 nm,说明两者结合过程发生了非辐射能量转移.同步荧光光谱和三维荧光光谱表明,HAR使BSA的色氨酸和酪氨酸残基所处的微环境极性增强、疏水性减弱,并导致BSA二级结构发生了改变.分子模拟结果显示,HAR更倾向于于BSA和HSA的亚结构域ⅡA(Site Ⅰ位点)结合.
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基于UPLC-Q-TOF-MS技术的牛血清白蛋白诱导过敏反应的代谢组学研究
运用代谢组学技术,研究牛血清白蛋白诱导过敏反应大鼠与正常生理状态大鼠尿液中内源性物质代谢的变化,筛选出与过敏反应相关的潜在生物标志物,进而分析其代谢通路,探讨过敏反应的代谢机制.采用牛血清白蛋白诱导大鼠发生过敏反应为模型,检测大鼠血清中组胺和类胰蛋白酶的含量,对大鼠肺和气管的组织形态学进行观察,通过UPLC-Q-TOF-MS技术对过敏反应模型组和空白对照组大鼠尿液进行代谢组学分析,采用主成分分析(PCA)和偏小二乘辨别分析(PLS-DA)的方法,观察2组大鼠尿液的代谢轮廓差异,筛选出差异代谢物.模型组和对照组的代谢谱图存在明显差异,并筛选出与过敏反应相关的14个差异代谢物,4条主要代谢通路.该文建立了基于UPLC-Q-TOF-MS技术进行牛血清白蛋白诱导过敏反应的大鼠尿液代谢组学研究方法,推测牛血清白蛋白诱导过敏反应的作用机制可能涉及异黄酮、叶酸的生物合成,色氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢等过程,为进一步探索代谢组学在药物过敏反应研究中的应用奠定了基础.
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肉苁蓉苷F与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究
目的:探讨咖啡酸类小分子肉苁蓉苷F与牛血清白蛋白的结合反应特性.方法:运用荧光光谱(Fs)、紫外-可见光谱(UV)和圆二色谱(CD)法探讨了生理条件下肉苁蓉苷F(该化合物为作者首次从紫珠属植物中分离得到,简记为CF)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.结果:计算得到CF-BSA的静态表观结合常数(Ka),结合位点数(n),能量转移效率(E),空间距离(r),热力学参数△G,△H,△S,与CF作用前后BSA中α-螺旋结构含量的变化,明确了CF在BSA上的结合位置,分析了几种常见金属离子对CF与BSA相互作用的影响.结论:CF与BSA形成基态复合物可导致BSA内源荧光猝灭,其在BSA上的结合位点数约为1,25℃时的结合常数Ka为4.36×104 L·mol-1,二者之间的空间距离r为3.09 nm,结合过程主要表现为氢键作用,CF在BSA上的作用位点为siteI,Mg2+,Fe3+,Cu2+,Zn2+的存在增强了CF与BSA的结合作用.猝灭机制主要为静态猝灭和非辐射能量转移.CD光谱表明CF对BSA的空间构型改变有一定的影响.
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大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定
脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular endothelial cells,SCMECs)参与构成血脊髓屏障,其功能变化与多种脊髓相关疾病相关.目前分离SCMECs的文献很少.本研究拟基于分离多种原代内皮细胞的经验[1-2],建立分离纯化SCMECs的方法.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂:DMEM(高糖)、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型胶原蛋白酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和l×PBS(北京协和医学院细胞中心);牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胶原蛋白酶/分散酶(collagenase/dispase)(Roche公司);嘌呤霉素(Sigma公司);内皮细胞培养基(ECM)(Scien Cell公司);兔抗大鼠yon Willebrand factor(vWF)抗体(SantaCruz公司);抗GFAP抗体和抗α-SMA抗体(Abcam公司);FITC标记和TRITC标记的二抗(北京中衫金桥公司).
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2.143黄连素对豚鼠结肠平滑肌细胞膜钙离子激活钾通道和延迟整流钾通道的影响
目的探讨黄连素治疗运动性腹泻的机制.方法取EWG/B豚鼠,体重250g～350g,雌雄不拘,于实验前24h禁食,12h禁水.击枕处死动物,取近端结肠约5cm,分离黏膜层和浆膜层得到肌条.将肌条剪成2mm×4mm小块,用含1%Ⅱ型胶原酶、1%胰蛋白酶抑制剂、2%牛血清白蛋白的消化液于37℃消化15min左右后洗净消化酶,实验前反复吹打得单个豚鼠结肠平滑肌细胞.
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BSA-PLGA微球的制备条件优化及不同添加剂对包封率的影响
目的探讨不同优化条件及添加剂对BSA-PLGA微球包封率的影响.方法采用水/油/水(W1/O/W2)的双乳化技术制备了BSA-PLGA微球,对影响其包封率的工艺进行了研究并考察了蔗糖、聚乙二醇和甘油对包封率的影响.结果采用优化条件制备的微球包封率为89.1%;BSA溶液中加入添加剂后,包封率可以提高到97.5%.结论采用水/油/水(W1/O/W2)的双乳化制备的BSA-PLGA微球可用于运载生物大分子药物,同时,提高内水相的粘度能够提高蛋白的包封率.
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影响磁珠共价偶联效率的因素分析
目的 研究不同条件下Dynabeads M-280 Tosylactivated磁珠与牛血清白蛋白(BSA)的偶联效率,探讨其影响因素.方法 分别取Dynabeads M-280 Tosylactivated磁珠与BSA混合,在不同的pH条件、不同的硫酸铵浓度和不同的BSA浓度下37℃振荡孵育18h,然后置于磁力架上静置2～3 min分离上清液.应用Bradford蛋白定量法对偶联前后的上清液进行蛋白定量分析,计算不同条件下的偶联效率.结果 当缓冲液pH值为9.5时偶联效率为1.12μgBSA/mg磁珠,pH值为7.4时偶联效率为0.41 μg BSA/mg磁珠；当反应体系中硫酸铵终浓度为1.2 mol/L时偶联效率为9.5 μg BSA/mg磁珠,硫酸铵浓度为0.8 mol/L时偶联效率为8μg BSA/mg磁珠；当偶联的BSA终浓度为0.4 mol/L时偶联效率为9.5μg BSA/mg磁珠,BSA浓度为0.6 mol/L时偶联效率为13 μg BSA/mg磁珠.结论 缓冲液pH值、硫酸铵浓度和BSA的浓度会影响Dynabeads M-280 Tosylactivated磁珠与BSA的偶联效率,该偶联过程在pH9.5、1.2 mol/L硫酸铵浓度和0.6 mol/L BSA的条件下进行较为适合.
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聚四氟乙烯纤维束膜外壁附牛血清蛋白吸附胆红素的初步研究
目的 探索使用生物相容性良好的聚四氟乙烯(PTFE)中空纤维管,并在其外壁附载牛血清白蛋白(BSA)制成一次性血浆滤过器,寻求一种安全有效、操作方便、费用合理的血浆净化清除胆红素方式.方法 胆红素吸附试验选取甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)接枝率为35%,每克MPTFE纤维附载BSA为75mg,用离心浇注法制成血浆滤过器,滤过器面积约为0.35m2.避光,恒温37℃,流速150～250ml/min.血浆在纤维管内循环,利用纤维管内外胆红素浓度梯度差,血浆中与白蛋白结合的胆红素解离扩散通过膜孔并与管壁外附着的BSA再结合,使滤器中胆红素浓度达到平衡;观察血浆中胆红素浓度随时间的变化.结果 血浆中胆红素浓度随透析时间的延长明显降低;在100min后趋于平衡,吸附率约为15.26%～32.11%.结论 MPTFE中空纤维管外壁修饰牛血清白蛋白(BSA)滤过吸附胆红素方法对血浆中胆红素有明显降低作用.由于吸附过程不与血浆直接接触,相对于分子吸附再循环(MARS)系统[1]简单,相比血浆灌流吸附解毒方式[2]更安全.
关键词： 胆红素 聚四氟乙烯中空纤维微管 牛血清白蛋白 -
一种与生物组织热凝固温度相似的可视化仿组织体模
目的 制作一种与生物组织热凝固温度相似的可视化仿组织体模并应用于射频消融研究.方法 仿组织体模主要由作为温度显示剂的牛血清白蛋白(BSA)和聚丙烯酰胺凝胶(PAG)构成,制作过程中通过柠檬酸缓冲液将其pH调节至4.3～4.7范围内.测定体模的透光度、吸光率、密度、导电率和比热等参数,并用射频对体模进行消融测试.结果 新制的体模为淡琥珀色、透明、韧性好、脆性小的固体状胶体.室温25℃时,体模在热凝固前的透光度为95%,吸光率为0.021,而热凝固后其透光度小于10%,吸光率为1.体模(pH=4.3)的密度为1.070 kg/m3,在温度37℃及频率为470 kHz下的导电率为0.116 s/m,比热为3567 J/(kg·℃).加热后凝固灶呈乳白色,边界清楚.结论 pH调节后的可视化PAG仿组织体模的凝固温度可下降至与生物组织热凝固温度相同范围,体模具有与生物组织相似的物理特性,适合于RFA的实验研究.
