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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-Id scFv),为研制HCV E2的抗-Id scFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCV E2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCV E2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCV E2特异性抗-Id scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-Id scFv与HCV E2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(E11 A450 nm 0.928,E14 A450 nm 1.152,E17 A450 nm 1.136,E28 A450 nm 1.163,E53 A450 nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11 A450nm 0.044,E14 A450 nm 0.062,E17 A450 nm 0.166,E28 A450nm 0.012,E53 A450 nm 0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(E28)阳性克隆提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCV E2的抗-Id scFv,本实验结果为开展用抗-Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.
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二十二碳六烯酸对心室肌细胞离子通道的影响
近年来,n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFAs)对心血管的有益作用已受到广泛重视.大量研究表明n-3PUFAs具有抗心律失常作用,能降低冠心病的猝死率及心肌梗死后恶性心律失常的发生率[1].基于这些研究结果,在心血管疾病的一级和二级预防中,美国和欧洲等心脏病学会推荐每日摄入小剂量n-3PUFAs[2].目前,n-3PUFAs抗心律失常的机制仍不完全清楚.n-3PUFAs主要包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA).本文通过膜片钳技术探讨DHA对大鼠心室肌细胞静息电位(RP)、动作电位时限(APD)、延迟整流性钾通道电流(IK)及内向整流性钾通道电流( IKl)的影响,阐述DHA抗心律失常的可能机制.1.材料和溶液组成:Axopatch 700B膜片钳放大器、Digi-Data 1322型数/模(或模/数)转换器、pClamp 9.0脉冲发放和数据采集软件(美国Axon Instruments公司).DHA(美国Sigma公司)以无水乙醇配制成50 mmol/L的母液,分装避光保存于-80℃备用.使用时无水乙醇的终浓度＜0.4％,以避免无水乙醇对离子通道的影响.牛血清白蛋白(BSA,美国Sigma公司)配制成2 mg/ml,4℃保存.
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蛋白尿肾损伤过程中凝血酶敏感蛋白表达的意义
为进一步探讨尿蛋白致肾损伤的机制,我们通过免疫组织化学染色及Northern杂交等方法,观察牛血清白蛋白(BSA)诱导的单侧肾切除大鼠肾损伤过程中,不同时间点蛋白尿对肾组织凝血酶敏感蛋白-1(TSP1)、纤维连接蛋白(FN)核酸及蛋白表达的影响及其意义.
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清解活血汤对兔自身免疫性视网膜血管炎病理学变化的影响
目的 探讨清解活血汤对牛血清白蛋白诱导的视网膜血管炎的治疗作用.方法 用牛血清白蛋白与弗试佐剂足底皮内注射及牛血清白蛋白玻璃体腔注射制作青紫蓝兔自身免疫性视网膜血管炎模型.模型动物分为阳性对照组、空白对照组、中药高剂量组、中药低剂量组；分别予地塞米松肌肉注射,生理盐水、高剂量中药及低剂量中药灌胃.观察各组实验兔的眼底表现和组织形态变化情况.结果 空白对照组的眼底改变主要有视网膜水肿、出血,静脉呈节段状粗大迂曲,视盘水肿,视网膜色素紊乱等.病理学检查见视网膜血管区域大量红细胞及炎性细胞,感光细胞层排列紊乱,RPE细胞色素增多、迁移或团簇,晚期神经纤维层局灶性坏死,感光细胞层缺失中断.其余各治疗组的眼底表现和病理切片结果好于空白对照组,中药高剂量组的视网膜损害小.结论 牛血清白蛋白诱导兔自身免疫性视网膜血管炎可作为一种良好的模型供将来研究使用.清解活血汤能有效控制模型动物的视网膜出血及炎症反应,高剂量药物的效果好.
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牛血清白蛋白与血管性疾病
牛血清白蛋白是一种球蛋白,目前已成功运用于血管性疾病实验动物模型的诱导及体外实验中.本文就牛血清白蛋白在血管性疾病中应用的相关机理进行综述.
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多孔钛支架表面沉积牛血清白蛋白/钙磷生物活性涂层的构建
目的：通过仿生法在多孔钛支架表面构建含有牛血清白蛋白的钙磷涂层，评价牛血清白的整合对钙磷涂层形貌、化学成分的影响。方法：利用选择性激光熔覆方法制备多孔钛支架，将多孔钛支架经碱液处理后，浸入模拟体液中4d进行预钙化，随后将2组支架分别浸泡于含牛血清白蛋白浓度为10μg/mL的饱和钙磷溶液、不含牛血清白蛋白的饱和钙磷溶液中2d。检测支架表面涂层形貌及物相组成。结果：牛血清白蛋白加入后，钙磷涂层晶体尺寸变小，由微米级结构变为纳米级；涂层成分由羟基磷灰石和磷酸八钙混合相转变为碳酸化的羟基磷灰石。结论：成功在多孔钛支架表面构建了牛血清白蛋白/钙磷复合涂层；牛血清白蛋白整合到钙磷涂层内部。
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米诺环素与牛血清白蛋白相互作用的研究
目的:研究人体生理条件下米诺环素与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用机制.方法:利用荧光光谱法,并以Stern-Volmer方程确定药物与蛋白的作用类型.结果:根据不同温度下米诺环素对BSA的荧光猝灭作用,证明两者间为单一的动态猝灭过程,根据Stern-Volmer方程求出了米诺环素与牛血清白蛋白(BSA)的猝灭常数,并根据Fǎrster能量转移理论确定了生理条件下药物与蛋白的结合距离为3.03 nm.结论:在人体生理条件下米诺环素对牛血清白蛋白具有荧光猝灭作用且为动态猝灭过程.同步荧光技术确定米诺环素对BSA构象有一定的影响.
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芋螺毒素GI抗血清制备及中和活性研究
目的 测定芋螺毒素GI与牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫小鼠后产生的抗血清是否具有中和GI毒素作用.方法 戊二醛法制备GI-BSA偶联物,免疫小鼠,制备GI小鼠抗血清,应用抗血清的抗体中和实验,验证其对GI的解毒作用.结果 SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,GI与BSA成功偶联,GI-BSA在>标志物相对分子质量(120×103)处有两条新蛋白带;GI-BSA(99 μg/只)每隔2周免疫1次,共免疫4次,第4次免疫后第10天抗血清中和滴度效价>1:64 000;混合100及200 μl 小鼠抗血清与≥1 LD50剂量GI,腹腔注射,100 μl 血清可使1×LD50毒素(16.3 μg/kg)组小鼠75%存活,200 μl血清可使25.8 μg/kg毒素组小鼠75%存活.结论 基于GI-BSA半抗原免疫的小鼠抗血清对GI毒素具有明显的解毒作用.
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光谱法研究卡比多巴与牛血清蛋白相互作用
目的 研究卡比多巴(CAR)与牛血清蛋白(BSA)相互作用的荧光猝灭类型、结合位点、结合常数、作用力类型和血清蛋白二级结构的变化情况.方法 采用紫外-可见光分光光度法、荧光光谱法和圆二色谱(CD)法等方法研究两者的相互作用,并通过计算得到相关参数.结果 通过紫外-可见分光光度法发现,在卡比多巴的作用下,BSA的大吸收峰发生了蓝移,蛋白质疏水性增强;通过荧光光谱法发现,卡比多巴导致BSA发生静态荧光猝灭.通过热力学计算得到两者结合的△G<0,△H>0,△S>0,因此其结合为自发进行的放热反应,主要相互作用力为疏水作用力.结论 CD结果表明,随着卡比多巴浓度的增加,BSA二级结构中α-螺旋的含量逐步明显减少,而β-转角、β-折叠和无规则卷曲均不同程度地增加.
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牛血清白蛋白乳酸-羟乙酸共聚物微球的制备
目的以牛血清白蛋白为模型蛋白,以乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)为包裹材料,探索粒径小于10μm的微球的制备方法并优化工艺.方法采用复乳溶剂挥发法制备蛋白质微球,以BCA法及微量BCA法测定微球的蛋白含量及蛋白从微球的释放.考察BSA浓度、内外相体积比、PLGA浓度、超声功率、匀浆转速、PVA浓度、PVA体积、PLGA分子量等因素对微球包封率、粒径、载药量及突释量的影响.结果通过控制不同的因素,可以得到较高的载药量及包封率、粒径在5μm左右的微球.结论采用复乳溶剂挥发法通过控制不同的因素,可得到粒径5μm左右不同载药量及突释量的具有较高包封率的微球.
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海藻酸钠-壳聚糖微囊成型机理及其对大分子药物的载药、释药研究
目的考察海藻酸钠-壳聚糖微囊成型机理及其对大分子药物的载药及释药特性.方法采用乳化胶凝法制备海藻酸钠-壳聚糖微囊,通过差示扫描量热法(DSC)探讨其成型机理.以牛血清白蛋白(BSA)为模型药,研究微囊对大分子药物的包载能力及释药特性.结果 DSC分析结果显示,组成微囊的各材料间发生静电相互作用而成型.随药载比增加,微囊中BSA的载药量由9.20%增至35.08%;随壳聚糖浓度升高,载药量由30.29%升至38.12%.载药微囊中BSA在PBS(pH 7.4)与0.1 mol*L-1 HCl中均呈两相释放;随CTS浓度增大,BSA在0.1 mol*L-1 HCl中的释放减慢.结论制备的微囊圆整且分散性好,微囊对BSA具较高包载能力,并具一定的缓释作用.
关键词： 海藻酸钠-壳聚糖微囊 差示扫描量热法 成型机理 牛血清白蛋白 -
氧氟沙星与牛血清白蛋白相互作用机制
目的以光谱技术与微量热技术相结合的方法研究水溶液中牛血清白蛋白与氧氟沙星分子间结合作用的机制.方法用荧光猝灭法及微量热法.结果荧光猝灭法测得该反应的结合常数K=1.20×105 L·mol-1,结合位点数n=1.20,微量热法测得反应的焓变ΔrHm≈0;用同步荧光技术考察氧氟沙星对牛血清白蛋白构象的影响;依据Fōrster非辐射能量转移机制,得到授体-受体间的结合距离(r=2.59 nm)和能量转移效率(E=0.38).结论牛血清白蛋白与氧氟沙星分子间有较强的结合作用,且结合力以疏水作用为主.
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肝细胞靶向甘草酸表面修饰白蛋白纳米粒的制备工艺
目的研究能主动靶向于肝实质细胞的甘草酸表面修饰白蛋白纳米粒的制备工艺.方法去溶剂化法制备普通纳米粒,以高碘酸盐氧化法制备甘草酸-白蛋白纳米粒偶联物.用2,4,6-三硝基苯磺酸显色法与凝胶柱色谱法验证是否偶联成功,HPLC法测定修饰纳米粒表面甘草酸密度.结果修饰纳米粒表面活性氨基数量较对照组减少19.6%;偶联于纳米粒表面的甘草酸密度为9.2%.纳米粒形态圆整,平均粒径为73 nm,在25 ℃和37 ℃条件下放置10 d后,性质稳定.结论甘草酸表面修饰白蛋白纳米粒制备成功,为进一步研究其对肝细胞的靶向性奠定了实验基础.
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海藻酸-壳聚糖-聚乳酸羟乙醇酸复合微球的制备及其对蛋白释放的调节
目的制备蛋白的海藻酸-壳聚糖-聚乳酸羟乙醇酸(PLGA)复合微球,以增加蛋白药物的包封率、减少突释和不完全释放.方法以牛血清白蛋白为模型药物采用修饰的乳化、醇洗法制备小粒径海藻酸微囊,再以壳聚糖孵育制得海藻酸-壳聚糖双层微囊,并进一步用PLGA包裹制得复合微球.采用微量BCA试剂盒测定蛋白浓度,考察其包封率及释放行为,改变各种制备因素调节微球的释放特性.结果复合微球粒径约30 μm,形态圆整.与单纯PLGA微球相比,包封率由60%-70%上升至80%以上.复合微球在磷酸盐缓冲液的1 h突释量由40%-50%下降至25%以下,在生理盐水中则进一步下降至5%以下.结论海藻酸-壳聚糖-PLGA复合微球提高了蛋白药物的包封率,减少了药物的突释,并可通过调节PLGA比例调节药物的释放.
关键词： 微球 海藻酸 壳聚糖 乳酸-羟乙醇酸共聚物 牛血清白蛋白 -
木犀草素、芹菜素与牛血清白蛋白相互作用的研究
目的研究木犀草素、芹菜素与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用机制.方法主要应用荧光猝灭法及非辐射能量转移原理.结果测得不同温度下,木犀草素、芹菜素与牛血清白蛋白的结合常数,确定两种黄酮小分子对牛血清白蛋白荧光的猝灭是静态猝灭过程,并依据能量转移原理求得其结合距离和能量转移效率.结论木犀草素、芹菜素与牛血清白蛋白间有较强的结合作用,且结合力以疏水作用力为主;B(3')-OH,B(4')-OH邻位对黄酮与牛血清白蛋白的结合具有增强作用.
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蛋白质分子间相互作用影响土大黄苷-蛋白质组相互作用的研究
荧光光谱结合全反射傅立叶红外光谱研究土大黄苷(rhaponticin,RT)与混合蛋白质组[BSA (bovine serum albumin)-BLF (bovine lactoferrin)]的相互作用,分析其相互作用的影响因子.荧光光谱实验表明,药物RT猝灭混合蛋白质组的荧光强度,蛋白质组的大发射波长明显红移,表明RT与蛋白质组之间存在着相互作用,该相互作用受蛋白质组中单组分蛋白质分子间相互作用及不同组分蛋白质分子间相互作用的影响.本工作建议用总体微环境因子(IOM)来定量表达影响RT-混合蛋白质组之间相互作用的溶液微环境因素.全反射傅立叶红外光谱法实验表明,药物RT与混合蛋白质组的相互作用过程中,蛋白质组中各组分蛋白质分子二级构象均发生了变化,分子结构不同,构象变化程度差异明显.蛋白质组中单组分蛋白质分子间的相互作用影响蛋白质分子二级构象变化,浓度与比例不同,相互作用不同,影响分子构象变化程度不同.荧光光谱与红外光谱结果基本一致,可为研究RT与BSA-BLF蛋白质组相互作用提供探讨性参考.
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黄芩苷-金属配合物与血清蛋白的分子作用机制研究
制各新型碳纳米管修饰玻碳电极(F-CNTs/GCE),建立F-CNTs/GCE分析黄芩苷-金属配合物(baicalinmetal complexes,BMC)与血清蛋白(bovin serum album,BSA)分子作用机制的研究新方法,并对该方法的原理深入探讨.模拟生理条件下,应用循环伏安法对BMC与BSA的相互作用性能进行热力学与动力学研究,推断BSA与BMC的分子作用机制.结果表明,F-CNTs的存在能加速电子传递,F-CNTs/GCE对BMC/BMC-BSA体系表现出较优的响应信号;利用新方法检测BMC-BSA的相互作用,表明BMC-BSA生成了热力学稳定非共价化合物,BMC-BSA的平均结合位点数为1.7,BMC/BMC-BSA反应过程的电子转移数为2,利用该方法推断BMC与BSA二者结合生成了一种非电化学活性的超分子化合物.本研究为药物与蛋白相互作用的分子机制研究提供新思路,对探讨非共价相互作用具有一定参考.
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包埋PLGA微球壳聚糖支架的构建及其对蛋白释放的调节
目的制备能缓慢释放蛋白类药物的细胞生长支架.方法采用冷冻干燥制备壳聚糖支架,测定支架的孔隙率和吸水率.以牛血清白蛋白(BSA)为模型药物,制备乳酸-羟乙醇酸共聚物(PLGA)微球,并包埋于壳聚糖支架中,用扫描电镜观察微球和支架的形态,考察药物在各种支架上的体外释放.结果壳聚糖支架为多孔结构,当预冻温度为-70℃时,支架的孔隙率和吸水率分别为78.6%±1.5%和85.1%±6.2%.PLGA微球能够较均匀地覆在壳聚糖支架上.单用壳聚糖支架,BSA在24 h累积释放达90%以上,制成PLGA微球后,再包埋于壳聚糖支架中,则药物释放明显缓慢,168 h的累积释放量为33.5%.通过改变壳聚糖的用量和PLGA材料的型号,可以调控药物在复合支架上的释放.结论包埋PLGA微球的壳聚糖支架有望用于组织工程的支架材料和生长因子的缓慢释放.
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环丙沙星与牛血清白蛋白的相互作用
血清白蛋白是血浆中含量丰富的重要载体蛋白,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合, 然后再被运送到身体的各部位.随着药代动力学及临床药理学迅猛发展,药物-蛋白质结合对药代动力学影响,又有了更深刻的认识.因此,研究药物与血清白蛋白的相互作用有重要意义[1].本文应用荧光光度法研究了生理pH值条件下,环丙沙星与牛血清白蛋白(BSA )的相互作用,利用环丙沙星对蛋白质荧光的猝灭求出环丙沙星与蛋白质的结合常数,考察了药物对蛋白质构象的影响,并根据热力学参数确定了它们之间的主要作用力类型.这对阐明药物在体内的输送和代谢过程,了解药物分子在生物体中的作用是很重要的.
