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环丙沙星与牛血清白蛋白的相互作用
血清白蛋白是血浆中含量丰富的重要载体蛋白,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合, 然后再被运送到身体的各部位.随着药代动力学及临床药理学迅猛发展,药物-蛋白质结合对药代动力学影响,又有了更深刻的认识.因此,研究药物与血清白蛋白的相互作用有重要意义[1].本文应用荧光光度法研究了生理pH值条件下,环丙沙星与牛血清白蛋白(BSA )的相互作用,利用环丙沙星对蛋白质荧光的猝灭求出环丙沙星与蛋白质的结合常数,考察了药物对蛋白质构象的影响,并根据热力学参数确定了它们之间的主要作用力类型.这对阐明药物在体内的输送和代谢过程,了解药物分子在生物体中的作用是很重要的.
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DNA与稠杂环芳烃农药相互作用的电化学发光测定法
目的 用电化学发光法研究含稠杂环芳烃结构的农药分子喹菌酮、噻菌灵及含稠环芳烃结构的农药甲萘威的代谢产物1,2-二羟基萘与双链DNA(ct-DNA)的相互作用.方法 将带正电荷的聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)与带负电荷的DNA层层自组装到玻碳电极(GCE)表面,构建核酸传感膜,以钌配合物二联吡啶二吡啶并[3,2-a:2',3'-c]吩嗪钌([Ru(bpy)2dppz]2+,简称Ru-dppz)作为电化学发光指示剂,以三丙胺(TPA)作为共反应物,利用有机化合物分子与Rudppz在DNA上的竞争置换作用,测定农药分子与DNA的结合常数.结果 喹菌酮、噻菌灵和1,2-二羟基萘与DNA的结合常数分别为2.78×105、0.083 6×105、0.104×105 L/mol.用紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法进一步证实了其竞争置换作用.根据构效关系阐明了该作用与农药分子结构之间可能存在的内在联系.结论 电化学发光法可以快速、准确地研究喹菌酮、噻菌灵和1,2-二羟基萘与DNA的相互作用.
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水溶性纳米硫化镉与明胶蛋白质的相互作用
利用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱研究了pH=12.0及不同温度下,水溶性硫化镉纳米晶与明胶结合反应的光谱行为,实验发现在明胶溶液中硫化镉的生成对明胶的内源荧光有较强的猝灭作用.用Lineweave Burk方程处理实验数据,发现硫化镉与明胶发生反应生成了配合物,结合红外和紫外-可见吸收光谱结果,属于静态荧光猝灭;计算了不同温度下反应的结合常数K(285 K:1.07×10~4 L/mol;292 K:9 69×10~3 L/mol:299 K:8.06×10~3 L/mol)及对应温度下结合反应的热力学参数(△H=-14.18 kJ/mol;△G=-21.98/-22.28/-22.36 kJ/mol: △S=27.36/27 74/27.36 J/(K·mol),证明二者主要靠静电作用力结合.根据F(o)rster的偶极偶极非辐射能量转移原理计算出结合位置距离色氨酸残基4 09 nm,发生分子内的非辐射能量转移,为探讨纳米颗粒与此类生物大分子之间相互作用的化学机制提供了重要的信息.
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槲皮素与锌离子结合性质及抗氧化活性研究
目的 研究槲皮素与其锌离子(Zn2+)配合物的抗氧化性能.方法 通过紫外/可见分光光度法测定槲皮素与Zn2+的结合比例及结合常数,结合核磁共振技术确定其结合位点,以1,1-二苯基苯肼(DPPH)为探针,比较研究槲皮素与其Zn2+配合物的抗氧化性能.结果 当槲皮素中低于2个酚羟基被中和时,槲皮素与Zn2+的饱和结合比为2:1;当超过3个酚羟基被中和时,槲皮素与Zn2+的结合比为1:1,此时槲皮素-Zn2+的表观结合常数为2.42×106 M-1.槲皮素的3'-O、4'-O参与了与Zn2+的配位.槲皮素-Zn2+配合物清除DPPH自由基的活性比槲皮素本身高出2.3倍.结论 Zn2+可与槲皮素形成稳定的配合物,且其比槲皮素本身具有更高效的抗氧化性能,这为传统中药槲皮素的应用提供了新思路.
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β-环糊精与白藜芦醇结合常数的亲和毛细管电泳测定
应用亲和毛细管电泳,在β-环糊精(β-CD)、硫酸化β-环糊精(SCD)二元环糊精体系中同时测定β-CD、SCD与顺、反式白藜芦醇和顺、反式白藜芦醇糖苷的结合常数.结果表明β-CD与4种单体形成了摩尔比为1:1的包合物.比较了4种单体与β-CD结合常数的大小,并对包合机理进行了讨论.
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普萘洛尔鼻用制剂的纤毛毒性(摘要)
目的筛选一种合适的剂型以降低鼻用制剂的鼻纤毛毒性。方法以盐酸普萘洛尔为模型药物，分别制备微球剂、复合乳剂和环糊精包合物。以在体蟾蜍上腭粘膜纤毛为动物模型，评价上述鼻用制剂对盐酸普萘洛尔纤毛毒性的改善作用。结果微球剂能有效地降低盐酸普萘洛尔的纤毛毒性；复合乳剂因包裹率较低，而环糊精因与药物的结合常数较小，使这2种制剂对纤毛毒性均无明显的改善作用。结论微球剂是降低药物鼻纤毛毒性的一种较为理想的剂型，机制主要是它的缓释作用。
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用荧光光谱法研究分子间结合常数和结合位点数时的公式选择
基于荧光猝灭的荧光光谱法在药物分子之间相互作用的研究中有重要地位和广泛应用.根据药物分子间相互作用结合比例、荧光分子和操作条件等的不同,应采用不同的计算公式计算结合常数.对目前常用的线性Stem-Volmer方程、Lineweaver-Burk曲线、双对数回归曲线、Scatehard方程和Tachiya模型等计算公式的适用范围及其应用进行讨论,为研究工作中公式的选取提供参考.
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手性药物佐米曲普坦的磺化β-环糊精毛细管电泳分析
目的:建立CE法检查手性药物佐米曲普坦中的对映异构体杂质[( R )-佐米曲普坦].方法:在20 mmol/L磷酸二氢钠缓冲液中加入1%磺化β-环糊精,溶解后,用磷酸调节pH至3.50,作为运行缓冲液;石英毛细管60 cm(有效长度51.5 cm)×50 μm ID;分离柱温为20 ℃;操作电压为-30 kV;气压进样(50 mbar,6 s);检测波长为220 nm.结果:佐米曲普坦与其对映异构体的分离度为6.66,( R )-佐米曲普坦浓度在4～80 μg/mL范围内线性良好(相关系数为0.999 8),进样精密度为2.83%,平均加样回收率为99.97%( n ＝9),检测限为1.5 μg/mL,磺化β-环糊精与( R )-佐米曲普坦、佐米曲普坦形成包容络合物的结合常数分别为964和905 mol-1.结论:该方法可用于佐米曲普坦的对映异构体杂质检查与结合常数的测定.
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亲和毛细管电泳法测定茶碱-人血清白蛋白的结合常数
目的:测定茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数.方法:亲和毛细管电泳法,以20 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含氨基乙酸0.5 mol/L,EDTA 1 mmol/L)为运行缓冲液,茶碱作为运行缓冲液的添加剂,样品为含5%丙酮的30 μmol/L人血清白蛋白溶液,采用更加可靠的描述性指标--淌度比(M)估算了茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数,检测波长为214 nm.结果:测得的茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数与文献值基本吻合.结论:亲和毛细管电泳法可用于茶碱-蛋白结合常数的快速测定.
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结晶紫与牛血清蛋白相互作用研究
运用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱研究了在缓冲溶液中不同温度下结晶紫(CV)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用.实验结果表明,CV对BSA的内源荧光猝灭为静态猝灭过程.测定了该反应在不同温度下的结合常数KA,KA分别为1.49×105L·md-1(25℃)、1.15×105L·mol-1 (35℃)和1.01×105L·mol-1 (45℃),CV与BSA以摩尔比1∶1结合.根据Forster非辐射能量转移理论,求出了37℃时给体(CV)和受体(BSA)之间结合距离为r=6.48nm.计算出的热力学参数表明,CV和BSA之间的作用力主要是通过疏水作用力相互作用.
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咖啡因与人血清白蛋白相互作用的分子光谱研究
目的 研究咖啡因(CAF)与人血清白蛋白(HSA)间非共价结合特征,探讨CAF在血液中的存在方式.方法 在模拟人体生理条件下,应用分子光谱技术,确定CAF与HSA相互作用方式、主要作用力类型及热力学参数.结果 CAF通过动态猝灭机制导致HSA荧光猝灭.当作用温度为298K和310K时,CAF与HSA表观结合常数(Kb)分别为3.35×105和9.53 ×104 L·mol-1,结合位点数分别为1.23和1.09;二者结合距离为4.76 nm;主要作用力为氢键或范德华力;同步荧光图谱表明色氨酸、苯丙氨酸残基所处微环境极性增强.结论 CAF与HSA相互作用并形成超分子化合物,该结合作用是一自发过程.
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青霉素与牛血清白蛋白相互作用研究
利用荧光光谱研究了青霉素与牛血清白蛋白的相互作用机制.由Lineweave-Burk双倒数图,求出了在281nm波长激发下,青霉素与BSA作用的结合常数k=3.347×10-3 K/mol;依据Stern-Volmer方程,以F0/F-1对c(Q)作图,推导出青霉素与BSA作用的双分子猝灭常数kq=2.46×1012mol/L·s.
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丹参酮与DNA相互作用的电化学研究
目的 研究丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮与DNA的相互作用.方法 采用电化学方法计算结合数,结合常数,并推测结合方式,用紫外光谱进一步验证结合方式.结果 每4摩尔丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ或丹参酮ⅡA可与l摩尔DNA碱基对形成复合物,而每1摩尔隐丹参酮可与1摩尔DNA碱基对结合形成复合物.它们与DNA的结合能力由强到弱分别为:丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮.结合方式均为静电作用.结论 丹参酮的共轭体系越大与DNA结合越牢固,并且不共面的甲基还具有空间位阻效应,降低丹参酮与DNA的结合能力.
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人源抗-D亲和力测定方法的建立及其验证
目的 建立1种相对简便的测量红细胞抗体亲和力方法,以之研究亲和力因素对红细胞抗体检测的影响.方法 根据亲和力公式,在红细胞与抗体反应达到平衡时,通过测量游离抗体浓度以及计算红细胞表面结合与未结合抗体的抗原比例,可计算出抗体与相应红细胞的结合常数(Ka)即亲和力.应用定量的R1R1红细胞吸收高效价人源抗-D,先测定饱和吸收抗-D的量,再测量不同浓度抗-D被定量红细胞吸收后游离抗体浓度,计算红细胞结合与未结合抗-D的D抗原的比值,推导出人源抗-D与R1R1细胞反应的结合常数.结果 检测中使用的人源抗-D与R1R1细胞反应亲和力为(2.1-7.6)×108;实验显示,红细胞结合抗体量越少,亲和力相对越高.平行检测的1例单克隆IgG抗-D的亲和力约为4.6×109,明显高于人源抗-D.结论 所建立的测量红细胞抗体亲和力方法更为简便,减少了出现偏差的机会,适用于基础、临床以及检测的方法研究.
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YM0402对映体的血浆蛋白结合率研究
目的 明确YM0402对映体与血浆蛋白结合是否存在立体选择性差异,揭示其主要结合的蛋白种类.方法 采用平衡透析法,将YM0402对映体与人血浆蛋白、人血清白蛋白(HSA)、α1-酸性糖蛋白(AGP)分别进行共孵育;分别取200 μL含药血浆、HAS、AGP加入样品室中,取350 μL缓冲液加入缓冲液室中,于37℃孵育4h后,采用手性高效液质联用法检测两侧样品的含量.色谱柱为大赛璐Chiralpak IA-3(150 mm ×2.1 mm,3μm),流动相为甲醇,流速0.25 mL· min-,柱温25℃,质谱采用正离子模式,多反应监测,离子通道分别为m/z 393→249 (YM0402)、m/z 427→235(内标).结果 0.2～ 15 μmol·L-YM0402对映体与人血浆蛋白的结合率均高于99％;在低浓度(0.2、1μmol·L-1)时,A-YM0402的结合率略高于B-YM0402.两对映体与HAS的结合常数分别为3.5×107、1.5 ×107 M-1,与AGP的结合常数分别为5.7 ×105、4.6 ×105 M-1.结论 YM0402对映体与人血浆蛋白具有高结合率,微弱的立体选择性来源于与HSA和AGP的共同作用.
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西布曲明对映体的毛细管电泳分离及结合常数的测定
目的 采用毛细管电泳法分离西布曲明对映体并测定其结合常数.方法 考察手性添加剂浓度、缓冲溶液pH及浓度、温度、分离电压等因素对分离度的影响,并采用双倒数法计算西布曲明对映体与2,6-二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)的结合常数.结果 在12.5 mmol·L~(-1)DM-β-CD、100 mmol·L~(-1)Tris-H_3PO_4(pH 2.5)缓冲液、16℃柱温,30 kV操作电压的毛细管电泳条件下,西布曲明对映体在9 min内获得了良好分离,分离度达2.0;结合常数分别为154.4、173.3 L·mol~(-1).结论 所用高效毛细管电泳方法快速、准确、可靠,适用于西布曲明对映体的分离;结合常数的计算可为研究西布曲明对映体的拆分机理提供依据.
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新型酰基转移酶AT-EF080951的重组表达及底物结合分析
目的 研究新型聚酮合酶(PKS)基因簇EF568935(Gen Bank登录号)中酰基转移酶(AT)EF080951(GenBank登录号)底物特异性,为PKS的功能研究及组合生物合成研究提供新组件.方法 从酰基转移酶AT-EF080951结构域两端的连接肽区设计引物,通过PCR克隆其结构域基因at-EF080951;连接入原核表达载体pMAL-c2X,与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达;直链淀粉树脂柱亲和层析纯化MBP-AT-EF08095l;融合蛋白用Xa因子切除MBP,得到AT-EF080951单体;以MBP、小牛血清白蛋白(BSA)为对照蛋白,用紫外分光光度法测定MBP-AT-EF080951与AT-EF080951对底物的结合能力,计算结合常数(Ka,μmol/L),分析其结合底物的特异性.结果 (1)MBP-AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.0049±0.001;丙二酰辅酶A,0.0049±0.003;乙酰辅酶A,0.107±0.002;辅酶A,0.005±0.003.(2)AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.005±0.002;丙二酰辅酶A,0.0041±0.002;乙酰辅酶A,0.120±0.001;辅酶A,0.0042±0.003.结论 MBP-AT-EF080951和AT-EF080951都特异性结合乙酰辅酶A,AT-EF080951可能是乙酰转移酶.
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毛细管电泳法快速测定大鼠血浆中丙吡胺游离药物和总药物浓度及血浆蛋白结合率
目的:建立一个全新、简单、快速的高效毛细管电泳方法,不需要对血浆样品进行任何前处理,血浆样品直接进样测定丙吡胺在大鼠血浆中的游离药物浓度和总药物浓度及血浆蛋白结合率.方法:采用40.2 cm未涂层石英毛细管(75 μm×375 μm,有效长度30 cm),分别以pH 7.4的20 mmol· L-1磷酸盐缓冲溶液和含有50 mmol· L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)的20 mmol· L-1磷酸盐缓冲溶液作为缓冲体系,测定游离药物浓度和总药物浓度.采用3.447 kPa压力直接进血浆样品5s,分离电压15 kV,温度20℃,检测波长190nm.结果:方法的专属性强,在线测定血浆中总药物浓度时,丙吡胺与蛋白的结合得到充分破坏并与血浆蛋白成分在5 min内达到基线分离,丙吡胺在血浆中总质量浓度分别在1.0～20.0 μg·mL-1和20.0～200.0 μg·mL-1的低、高浓度区间内呈现良好的线性关系,相关系数分别为0.999 2和0.997 7,回收率为93.8％～110.7％.在体外血浆生物样品中,当预温孵的丙吡胺质量浓度为100、50、25、12.5、10 μg· mL-1时,血浆蛋白结合率平均值为86.7％、86.3％、86.4％、78.3％、74.7％.在体内血浆生物样品中,丙吡胺血浆蛋白结合率平均值范围在39.3％～91.5％.测定结果表明丙吡胺与大鼠血浆蛋白的结合具有一强、一弱2个结合位点,结合常数分别为5.3×104 mol-1.L和1.2×102 mol-1·L.绘制了大鼠在给药后24h体内丙吡胺游离和总药物浓度的药时曲线.结论:利用所建立的新方法,将含丙吡胺的血浆生物样品直接进样,高效、快速地测定了大鼠体内外血浆生物样品中丙吡胺的游离药物和总药物浓度.新建立的方法灵敏,高效快速,操作简单,耗样量少,价廉,有潜在的广泛的应用价值.
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脂质体平衡透析-高效液相色谱联用筛选复方开心散中膜通透性成分 的研究
目的:研究复方开心散提取液中与脂质体的相互作用及其作用成分.方法:应用脂质体平衡透析与高效液相色谱联用技术,对开心散水提物、乙醇提物中与脂质体有相互作用的成分进行分析和鉴定.比较了开心散水提取液和乙醇提取液中膜通透性成分的异同,并考察了脂质体浓度、缓冲液pH及透析时间对其相互作用的影响.结果:2种开心散提取液中各有14种成分明显与脂质体相互作用.通过标准品分析鉴定了开心散乙醇提取液中的特有2种膜通透性成分,分别为 α-细辛醚 、β-细辛醚.脂质体浓度对两种开心散提取液与脂质体相互作用影响很大;pH值对不同成分的影响不同.开心散乙醇提取物与水提物中与脂质体发生结合作用的成分大部分相同.结论:采用脂质体平衡透析和高效液相色谱-质谱联用的方法,能方便、有效地预测复方开心散在体内的吸收情况,为开心散的药效物质基础研究提供依据.
