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用于人胚肺二倍体细胞培养的MEM产品比较试验
在相同实验条件下,比较了无锡市美迪生物制品有限公司生产的MEM和日本日水公司生产的MEM,在人胚肺二倍体细胞培养过程中,细胞贴壁、细胞形态、分裂速度,增殖数量,维持时间等情况,结果美迪公司MEM和日水MEM在细胞生长各个方面均无差异,完全可以支持人胚肺二倍体细胞的生长.
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Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究
选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础.Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0 MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7 d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态.结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6 d为病毒在细胞内的增殖高峰期.
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脊髓灰质炎病毒减毒株Sabin 3经型间嵌合在人胚肺二倍体细胞(KMB17)上的适应性研究
为筛选Sabin 3型人胚肺二倍体细胞新适应株,将原来在体外培养过程中对KMB17细胞适应较差的Sabin 3型病毒与适应较好的Sabin 1型病毒混合培养11代,经噬斑筛选81个克隆后,感染性滴度检测表明,大部分筛选的克隆感染性滴度较低,仅33号克隆滴度高,达8.125 LgCCID50/ml.经全基因序列分析发现,该克隆(Sabin 3-33)为Sabin 1型和Sabin 3型的型间嵌合株,其中5'NCR为Sabin 1型,其余区域与Sabin 3型相同.经型别鉴定为Sabin 3型,与毒力直接相关的位点5'NCR的第480位核苷酸及位于VP2的第2 034位核苷酸都未发生变异,表明已初步获得一株人胚肺二倍体细胞KMB17的新适应株.
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Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5'端非编码区变异关系
脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7.5kb.其5'端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关[1].
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不同MEM培养基培养2BS细胞生长情况比较
目的：比较海克隆、日水MEM培养基培养2BS细胞生长过程的细胞贴壁、细胞形态、分裂速度、单层数量等生长情况。方法分别按标准配制日水、海克隆两种MEM培养基,2BS细胞从复苏开始分别用两种培养基进行传代培养。比较细胞生长状况及形态。结果海克隆公司MEM和日水MEM在细胞生长各个方面均无差异,符合人胚肺二倍体细胞的生长需要。结论美国海克隆实验公司的MEM培养基完全支持2BS细胞的生长要求。
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水痘病毒在感染HAV2BS细胞中形态变化
目的分析水痘病毒(VZV)在感染甲肝病毒(HAV)的二倍体成纤维细胞(2BS细胞)中的形态发生过程.方法将已感染甲肝病毒21 d后的2BS细胞感染水痘病毒(实验组),分别于不同时间收获细胞,用超薄切片和负染的方法制备电镜样品;同时以单独感染HAV、VZV的2BS细胞做对照,进行电镜观察.结果实验组2BS细胞中可见甲肝病毒和不同形态的水痘病毒.结论VZV可以再度感染已被HAV感染的2BS细胞并有完整的子代病毒产生;VZV在已感染HAV的2BS细胞中的增殖受到甲肝病毒干扰,增殖数量少于VZV单独感染2BS细胞中的子代病毒量,并且复制周期延长.
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热休克条件下诱导型HSP70对人胚肺二倍体细胞衰老影响实验研究
目的 探讨在热休克条件下,人胚肺二倍体细胞MRC-5株诱导型热休克蛋白70(HSP70)在细胞水平的表达机制,诱导型HSP70 对MRC-5细胞衰老有无影响及影响MRC-5细胞衰老的相关机制.方法 用热休克处理诱导MRC-5细胞HSP70的表达,同时采用HSP70反义寡核苷酸转染MRC-5细胞作对照,分别置42℃恒温水浴30 min、1、2、4 h,及每日水浴1 h 共3和5 d,各组细胞均在37℃复温.分别测定细胞HSP70的表达,细胞超氧化物歧化酶(SOD)总活力,并通过衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和显微镜观察判断衰老细胞.结果 在42℃热休克处理下,MRC-5细胞HSP70的表达随热处理时间延长而增加(P＜0.05),且均高于同时点对照组水平(P＜0.05);MRC-5细胞SOD总活力随热处理时间延长而增高,均高于同时间点对照组水平,差异有统计学意义(P＜0.05);经HSP70反义寡核苷酸处理的细胞,在反复热处理第3天及第5天,SA-β-Gal染色阳性表达率高于实验组.结论 热处理方法可成功诱导MRC-5细胞表达HSP70,随热处理时间延长,MRC-5细胞HSP70表达增加,HSP70可能通过增强细胞内源性抗氧自由基能力,影响MRC-5细胞的衰老进程.
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Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化
目的 筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性.方法 将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别；病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化；免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态.结果 在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID5o/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因；病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常.结论 成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性.
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Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的适应性及其生物学特性
目的 研究Ⅳ型登革病毒中国株LD34在人胚肺二倍体细胞KMB17上的传代适应性及其生物学特性.方法 将Ⅳ型登革病毒中国株LD34在C6/36细胞上扩增,并采用微量细胞病变法测定病毒的感染性滴度.以2.0 MOI的病毒接种KMB17细胞传代培养,筛选KMB17细胞适应株,并进行培养条件的优化.将Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株连续传10代,测定病毒的感染性滴度,免疫荧光法检测病毒的抗原性,RT-PCR法扩增登革病毒的特异性基因.结果 筛选出的Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的佳培养条件为病毒接种MOI 0.4,培养基血清浓度5％;其感染KMB17细胞后可产生明显的细胞病变(CPE),连续传10代,病毒滴度达7.75 CCID50/ml;第10代病毒的抗原性呈阳性;第10代病毒能扩增出511 bp的登革病毒特异性基因和393 bp的Ⅳ型登革病毒特异性基因.结论 获得了Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株,病毒保持了原始毒株的基本生物学特性,且具有较好的抗原性.
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3种培养方法培养脊髓灰质炎病毒过程中病毒繁殖特性比较
目的 比较3种培养方法培养脊髓灰质炎病毒过程中病毒繁殖动力学特性.方法 分别用悬浮吸附法、静止吸附法和非吸附法培养脊髓灰质炎病毒(Sabin Ⅰ、Ⅱ、中Ⅲ2型),分别在间隔12 h时取样,至细胞完全病变或96 h,用微量细胞病变法检测感染性滴度,绘制病毒一步生长曲线.结果 悬浮吸附法病毒增殖快,2:1分种率时,60 h细胞完全病变,滴度高,分别为Sabin Ⅰ型9.000 LgCCID50/ml、SabinⅡ型8.500 LgCCID50/ml、中Ⅲ2型8.750 LgCCID50/ml;1:1分种率时,Sabin Ⅰ型在60 h完全病变,滴度为8.875 LgCCID50/ml,SabinⅡ型和中Ⅲ2型在70 h完全病变,滴度分别为8.000 LgCCID50/ml和8.125 LgCCID50/ml;静止吸附法1与静止吸附法2差异不明显,96 h时,仍有约10%～20%细胞未发生病变,静止吸附法1滴度为Sabin Ⅰ型7.125 LgCCID50/ml、SabinⅡ型6.500 LgCCID50/ml、中Ⅲ2型6.375 LgCCID50/ml,静止吸附法2滴度为Sabin Ⅰ型7.250 LgCCID50/ml、SabinⅡ型6.875 LgCCID50/ml、中Ⅲ2型7.000 LgCCID50/ml;非吸附培养法,在96 h,有20%细胞未发生病变或病变程度较轻.滴度为Sabin Ⅰ型7.250 LgCCID50/ml、SabinⅡ型5.625 LgCCID50/ml、中Ⅲ2型6.375 LgCCID50/ml.在12 h,悬浮吸附法(分种率2:1)培养三型病毒滴度已分别达到6.000、6.125和6.250 LgCCID50/ml,略高于悬浮吸附法(分种率1:1)达到的值,而静止吸附法及非吸附法培养至36 h,病毒滴度才达到相近的水平.结论 在3种培养方法中,悬浮吸附法明显优于静止吸附法和非吸附法.
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悬浮吸附法在人胚肺二倍体细胞(KMB17)中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒
目的研究在KMB17细胞中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒及其用于生产疫苗的可行性.方法应用悬浮吸附和添加血清的方法,在KMB17细胞上培养Sabin Ⅰ、Ⅱ、中Ⅲ2型病毒,用微量法检测病毒滴度.结果在悬浮吸附加10%血清培养条件下,Sabin Ⅰ滴度可达8.125 LgCCID50,SabinⅡ滴度可达7.5 LgCCID50,中Ⅲ2滴度可达7.583 LgCCID50.与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度比较,差异无显著意义(P＞0.05).结论可进一步研究应用KMB17细胞进行疫苗生产.
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乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂BW284C51抑制无血清诱导的凋亡
为了研究AChE特异性抑制剂BW284C51与细胞凋亡的关系,采用人二倍体胚肺细胞株KMB17经无血清培养方法诱导出典型凋亡,在无血清培养液中加入10 μmo/L乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂BW284C51.结果:乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂BW284C51具有抑制无血清诱导的凋亡,AChE参与了细胞凋亡的信号传导,抑制该酶的活性就能抑制凋亡的发生.结果表明:AChE在凋亡过程中可能起非常重要的作用,参与了凋亡过程中关键凋亡信号的传导.
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狂犬病病毒 CTN-1V 株在人二倍体细胞W alvax-2株的适应传代
目的：建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞，连续传代，检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞，通过连续带毒传代至第7代，病毒滴度可达6．78 lg LD50/mL，并在第10～15代内滴度维持在7．0 lg LD50/mL以上，15～30代滴度稳定在7．0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液，各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部（2010版）的要求，疫苗效力在6．0 IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。
关键词： 狂犬病毒CTN-1V株 人胚肺二倍体细胞 适应 传代 狂犬病疫苗 -
胡麻油烟凝聚物诱导人胚肺二倍体细胞恶性转化作用
背景与目的:研究胡麻油烟对人体潜在的致癌危险性.材料与方法:以胡麻油烟凝聚物(SOFA)作为受试物染毒人胚肺二倍体细胞,建立体外恶性转化实验系统,对转化细胞进行ConA凝集实验、软琼脂培养实验以及裸鼠体内致瘤实验,观察并检测细胞是否发生恶性变.结果:实验剂量范围内的SOFA(25～400 μg/ml)能够诱导人胚肺二倍体细胞形成细胞恶性转化灶,转化灶细胞生长失去接触抑制性、饱和密度增大、ConA凝集能力增强、锚着依赖性丧失及裸鼠体内具有成瘤性等多种细胞发生恶性变的生物学特性改变.结论:SOFA具有诱导人胚肺二倍体细胞恶性转化的作用,对人体具有潜在致癌作用.
