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尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因杂合型的分子特征
目的 研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因EstB2杂合型的分子特征.方法 采集杭州市自然种群库蚊,提取单蚊DNA基因组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法进行抗性相关酯酶的基因分型.对酯酶B2基因Estβ2型蚊虫的PCR产物,进一步选用Bfm Ⅰ内切酶进行酶切,确定酯酶B2基因Estβ2纯合犁及Estβ2杂合型.本次研究共提取207只单蚊DNA,156份PCR样本阳性,阳性率75.36%(156/207).结果 在156份PCR样本阳性,酯酶B2基因Estβ2型占28.20%(44/156);对该基因型进一步分型,其中Estβ2纯合型占90.90%(30/33),EstB2杂合型占9%(3/33);Estβ2杂合型是以Estβ2和一种亚型杂合(Estβ2/Estβ2<'1>)形式存在.结论 建立了在自然种群尖音库蚊复组中酯酶B2基因分型方法,研究证明了杭州自然种群库蚊存在一种有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型.
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ERCC1基因多态性与卵巢上皮性癌患者铂类药物化疗敏感性及预后的关系
目的 探讨切除修复交叉互补基因1(ERCC1)的单核苷酸多态性(SNP)与卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者铂类药物化疗敏感性和预后的关系.方法 通过Haploview软件(Version4.2;http://www.broadinstitute.org)筛选出ERCC1基因的6个标签SNP(tagSNP)位点,即rsl1615、rs3212986、rs735482、rs3212955、rs12610134、rs3212958位点,采用单碱基延伸(Snapshot)法检测220例卵巢癌患者ERCC1基因6个tagSNP位点的基因型.比较铂类药物敏感(147例)和不敏感(73例)、复发(135例)和未复发(85例)、死亡(92例)和存活(128例)患者的ERCC1基因6个tagSNP位点的基因型频率;并对携带ERCC1基因6个tagSNP位点不同基因型的卵巢癌患者的预后进行比较,评价患者预后的指标包括疾病无进展生存时间(PFS)和总生存时间(OS).结果 ERCC1基因rs1615位点CC、CT、TT基因型频率,铂类药物敏感(分别为53.1％、45.6％、1.4％)与不敏感(分别为52.0％、35.6％、12.3％)、复发(分别为54.8％、37.0％、8.2％)与未复发(分别为49.4％、50.6％、0)、死亡(分别为51.1％、39.1％、9.8％)与存活(分别为53.9％、44.5％、1.6％)患者分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);与携带CC基因型的卵巢癌患者相比,携带TT基因型患者的铂类药物化疗敏感性明显降低(OR =6.22,95％CI为1.12 ～34.42).log-rank分析显示,ERCCl基因rs11615位点CC、CT、TT基因型频率与卵巢癌患者的PFS和OS均明显相关(P ＜0.01);Cox比例风险回归模型分析表明,与携带CC基因型的卵巢癌患者相比,携带TT基因型患者的PFS(分别为21.1、8.6个月;HR =2.19,95％ CI为1.14 ～4.22,P=0.009)和OS(分别为28.5、19.3个月;HR =2.22,95％ CI为1.06 ～4.64,P =0.021)均明显缩短.而另外5个tagSNP(即rs3212986、rs735482、rs3212955、rs12610134、rs3212958)位点的基因型分布与卵巢癌患者的化疗敏感性及预后均无关(P＞0.05).结论ERCC1基因rs11615位点的SNP可能成为预测卵巢癌患者铂类药物化疗敏感性及预后的分子标志物
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XPG基因表达下调对卵巢上皮性癌耐药细胞增殖及顺铂耐药性的影响
目的 探讨XPG基因表达下调对卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞增殖及顺铂耐药性的影响.方法 针对XPG mRNA的不同区域设计不同的小分子干扰RNA( siRNA)片段(共3个,包括siRNA-XPG-733、1279和3227),瞬时转染卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP细胞,实时荧光定量PCR技术检测瞬时转染后SKOV3/DDP细胞中XPG mRNA的表达；选择对XPG mRNA表达抑制率高的siRNA-XPG干扰片段,构建短发夹状RNA(shRNA)-XPG重组表达载体,转染SKOV3/DDP细胞；采用氨基糖甙类抗生素G418筛选、蛋白印迹法鉴定,确认获得XPG基因表达下调的shRNA-XPG-SKOV3/DDP细胞.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测shRNA-XPG-SKOV3/DDP细胞增殖情况和顺铂耐药性,采用流式细胞仪和高效液相色谱法分别检测其细胞周期比例和细胞内顺铂浓度,转染以内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) siRNA构建的shRNA-GAPDH重组表达载体的SKOV3/DDP细胞为阳性对照,转染以XPG无关序列构建的shRNA-NC重组表达载体的SKOV3/DDP细胞为阴性对照.结果 (1)实时荧光定量PCR技术检测显示,siRNA-XPG-733干扰片段转染后SKOV3/DDP细胞中XPG mRNA的表达水平低,对XPG mRNA表达抑制率高,达53.8％.构建shRNA-XPG-733重组表达载体,转染SKOV3/DDP细胞,获得shRNA-XPG-733-SKOV3/DDP细胞,该细胞中XPG蛋白表达明显下调.(2) MMT比色法检测显示,shRNA-XPG-733-SKOV3/DDP细胞的增殖速度明显低于阳性对照和阴性对照(P＜0.05).流式细胞仪检测显示,shRNA-XPG-733-SKOV3/DDP细胞的S+G2/M期细胞比例为34.0％,与阳性对照和阴性对照(分别为58.7％和51.3％)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).MMT比色法检测显示,shRNA-XPG-733-SKOV3/DDP细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50)为( 13.79 ±0.06) μg/ml,明显低于阳性对照和阴性对照[分别为(27.84±0.34)和(28.32 ±0.42)μg/ml],差异均有统计学意义(P＜0.05)；但经顺铂处理后,shRNA-XPG-733-SKOV3/DDP细胞内顺铂浓度为(0.026±0.005) μg/ml,与阳性对照和阴性对照[分别为(0.024±0.003)和(0.025±0.007) μg/ml]比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 shRNA-XPG-733-SKOV3/DDP细胞中XPG基因表达下调导致其细胞增殖减慢、对顺铂的耐药性下降.
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氟化物对限制性内切酶酶切活性改变的研究
目的:探讨氟化物对限制性内切酶酶切作用改变的影响.方法:常规方法提取纯化PBR322质粒;将NaF与PBR322质粒37℃共同作用1 h,再用限制性内切酶BamH1对PBR322质粒进行酶切3 h,同时将NaF作用的PBR322用层析柱纯化后再进行酶切反应;将酶切产物进行电泳,观察结果并拍照.结果:随着NaF浓度的增加,BamH1对PBR322的酶切作用减弱,当加入5 mmol/L NaF时,BamH1几乎无酶切活性,而对加入5 mmol/L NaF的PBR322用层析柱进行纯化,以除去NaF,再对其进行酶切,可完全切开.而且氟离子可导致酶切片段在电泳中显示拖尾现象.结论:氟化物可抑制限制性内切酶的酶切活性.
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鼻咽癌组织ERCC1的表达及其临床意义
目的:探讨核苷酸切除修复交叉互补基因(ERCC1)在鼻咽癌(NPC)组织中表达及其与顺铂(DDP)化疗疗效的关系.方法:82例经鼻咽部肿物活检确诊为鼻咽低分化鳞癌患者接受DDP为基础化疗,应用免疫组化法检测鼻咽部癌组织ERCC1基因蛋白表达,并设34例NPC癌旁上皮组织为对照组.结果:在NPC癌旁上皮组织中ERCC1的阳性率为88.2%,明显高于NPC组织中ERCC1阳性率(63.4%),P＜0.05;ERCC1基因蛋白表达阳性患者化疗有效率为36.5%,ERCC1阴性患者有效率为63.3%,其差异有统计学意义,P＜0.05.ERCC1表达与NPC患者年龄有关(P＜0.05),与性别、T分期、N分期及M分期无关,P＞0.05.结论:ERCC1异常表达是NPC DDP化疗耐药的一个重要因素,检测ERCC1基因有助于预测NPC患者对顺铂化疗敏感性.
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Poly（A）加尾-RNase H消化-RT-PCR法分析应激诱导生成5′端tRNA半分子
目的：建立一种简便、快速检测应激诱导细胞生成的5′端转移RNA（ tRNA）半分子的方法。方法提取应激诱导细胞RNA，用poly（ A）加尾酶在RNA分子3′端加尾后，加入与待测tRNA的3′端部分序列互补的简并DNA探针杂交，经RNase H消化与DNA探针互补的tRNA序列，再由oligo（ dT） n锚定引物进行逆转录获得互补DNA（ cDNA），以5′端tRNA半分子和锚定引物的序列为PCR反应的上下游引物，PCR扩增检测5′端tRNA半分子。结果经poly（ A）加尾-RNaseH消化-RT-PCR-电泳等步骤，可以实现对5′端tRNA半分子的检测分析。结论 poly （ A）加尾-RNaseH消化-RT-PCR法的建立实现了5′端tRNA半分子的简便、快速检测分析，为tRNA半分子生物学功能研究和检测分析提供了工具。
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多发性骨髓瘤特异APE1siRNA表达载体的构建及鉴定
目的构建多发性骨髓瘤(MM)特异的APE1siRNA表达载体pSilencer K-IE-IgP-APE1siRNA,观察其对MM细胞APE1蛋白表达的特异性敲除作用.方法设计合成的APE1siRNAcDNA序列与线性化pSilencer 2.0-U6母本质粒连接后,用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切,插入IgP寡核苷酸片段;随后用EcoR Ⅰ酶切pSilencerIgP-APE1 siRNA,将线性化载体与回收IEcDNA片段用T4 DNA连接酶连接;再用Xho Ⅰ酶切,与回收Kappa cDNA片段连接,克隆出MM特异表达载体pSilencer K-IE-IgPAPE1siRNA,每次连接后均经酶切鉴定和测序确认.用脂质体转染法将重组质粒转染KM3、HOS和MDA-231细胞,Western blot分析其对KM3细胞APE1的特异性敲除作用.结果pSilencer K-IE-IgP-APE1siRNA能特异且有效地敲除KM3细胞APE1蛋白表达,转染siRNA后培养2 d的KM3细胞APE1相对表达水平为0.118±0.047,而单独脂质体转染组,APE1相对表达水平为0.988±0.029,基因缄默效率为90%.结论成功构建了针对MM的APE1siRNA表达载体.
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蜘蛛拖丝蛋白基因亚克隆与全序列测序对其结构与功能了解的意义
目的:了解蜘蛛拖丝蛋白基因的结构,利用基因工程技术制备人工蛛丝纤维,开发具有独特的机械特性和良好生物相容性的新型蜘蛛丝纤维生物材料.方法 :通过结合限制性内切酶消化和超声波机械剪切蜘蛛拖丝蛋白全基因克隆 ScosDS-1DNA,制备的 DNA片段分别与载体 pUC19连接,构建了 4个拖丝蛋白基因亚克隆文库.筛选、鉴定亚克隆文库的重组子,选取大小合适的重组子进行测序.结果 :筛选的重组子数目超过 400个,成功完成的测序反应数近 500次,总读长已为 ScosDS-1全长的 5倍.结论 :初步进行了 ScosDS-1全序列拼接,以进一步了解拖丝蛋白基因的结构与功能 ,为合理的设计化合成基因,人工仿制蛛丝纤维奠定了基础.
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APE1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建APE1基因慢病毒载体,为其后续的体内外实验研究提供基础. 方法 应用基因工程技术,筛选出两条针对APE1基因的RNAi靶序列KD1、KD2,分别与pGCIL-GFP载体连接,经转化筛选鉴定后,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,分别命名为LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2,两种病毒颗粒分别感染MHCC97-H细胞,设为感染LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2细胞组,同时设未感染病毒组和感染空载体细胞组.Real-time PCR和Western blot检测MHCC97-H细胞中APE1基因的mRNA和蛋白的表达. 结果 PCR及测序结果与预期结果一致,LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2的病毒滴度为4×108 TU/mL和7×108 TU/mL.与未感染病毒组和感染空载体细胞组相比,2组慢病毒组APE1基因mRNA和蛋白的表达均明显下降,LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2对APE1基因的mRNA表达的抑制率分别为75%,90%,对APE1蛋白表达的抑制率达90%,95%. 结论 成功构建高效阻断APE1基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究APE1基因在肝癌中的作用机制和基因治疗奠定基础.
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APE1在肝细胞癌组织芯片的表达及临床病理意义
目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)基因在原发性肝细胞癌(HCC)的表达及其与临床病理变化的关系.方法 应用免疫组织化学方法,检测包含HCC及转移灶、癌旁肝硬化组织、癌旁慢性肝炎组织和正常肝组织的组织芯片中APE1的表达情况,结合临床病理资料进行统计分析.结果 APE1在癌旁肝硬化组织、癌旁慢性肝炎组织和正常肝组织以细胞核表达为主,在HCC和转移灶组织以细胞质细胞核联合表达为主(P＜0.01).细胞质与细胞核染色强度均与HCC分级和转移密切相关(P＜0.01),细胞质染色强度还与肿瘤包膜有无浸润有关(P＜0.01).结论 APE1蛋白表达与HCC恶性表型有关,APE1蛋白过表达及细胞质表达的出现可能成为HCC预后不良的指标之一.
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片状核酸内切酶1在食管鳞状细胞癌中的表达及意义
目的 片状核酸内切酶1(FEN1)基因是与DNA复制和修复有关的基因.有关FEN1在食管鳞癌中的研究至今未见报道.本研究检测FEN1在食管鳞癌中的表达状态,希望揭示FEN1与食管鳞癌之间的可能关系.方法 运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测FEN1在62例食管鳞癌和癌旁上皮中的表达状态;探讨FEN1的变化与临床和病理参数的关系.结果 36例(58%)癌组织显示FEN1表达上调;23例(37%)癌旁上皮FEN1表达上调;FEN1在食管鳞癌组织和癌旁上皮组织中的表达状态差异有统计学意义.不同分期、分级、淋巴结转移、性别和年龄FEN1表达状态差异无统计学意义.结论 FEN1可能是一个参与食管鳞癌发生发展的一个有价值的分子标志物.
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Ⅰ-Sce I系统的建立及其在诱导肝癌细胞DNA双链断裂中的应用
目的 建立Ⅰ-Sce I系统并应用该系统制备DNA双链断裂(DSB)的HepG2细胞模型,为进一步研究DSB与HBV DNA整合奠定基础.方法 通过分子克隆技术构建携带Ⅰ-Sce I内切酶识别序列的pEGFP2真核表达载体,并将其转染入肝癌细胞株HepG2,经G418筛选出稳定转染株,随后瞬时转染表达归位内切酶Ⅰ-Sce I的质粒pCMV-3NSL-Ⅰ-Sce I.24 h后采用免疫荧光法和Western blot检测DNA双链损伤效应分子γ-H2AX的表达,了解DSB情况.结果 酶切鉴定和测序证实pEGFP2构建成功;Ⅰ-Sce I系统引入后HepG2细胞中的γ-H2AX表达明显上调,提示DSB细胞模型构建成功.结论 Ⅰ-Sce I系统能够成功地诱导HepG2细胞株基因组发生DSB,该系统有望为进一步探讨DSB是否为HBV整合的潜在靶位提供有效的研究工具.
