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银染mRNA差异显示方法的建立
目的建立银染mRNA差异显示方法,为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础. 方法采用随机引物和锚定引物各1条,建立差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)和银染方法,对DDRT-PCR过程中各实验影响因素进行优化,割取差异条带进行二次扩增. 结果当总RNA用量为0.2 μg,引物浓度为0.6～1.0 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,MgCl2浓度为1.6～2.0 mmol/L时,同时起始5个循环的退火温度为50 ℃,扩增效率佳,特异性好,背景干净. 结论 DDRT-PCR方法简便、快捷、灵敏、高效,可用于分离差异表达基因.
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用Chelex法制备AP-PCR细菌DNA模板
近年来,DNA分析技术已被广泛应用于口腔细菌学的研究.当前研究细菌基因分型的方法较多,包括质粒DNA图谱、染色体DNA指纹、核型分析法等,但这些传统方法都有一共同缺陷,即技术复杂,费时费力+[1].因此随着近年来随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)技术的不断完善,由于其对口腔同种细菌不同克隆型的分辨力好,而操作又较其他经典方法简便、快捷,已被广泛应用于口腔细菌的研究中[2].目前AP-PCR DNA模板的制备大多仍采用传统的DNA提取方法,即通过蛋白酶K消化菌细胞,酚、氯仿抽提而获取DNA.这种方法操作复杂,费时.同时,需要在多个离心管之间转移,增加了标本被污染的可能性.为更简便快速地获得AP-PCR模板DNA,笔者探讨采用Chelex 100为介质提取细菌DNA的可行性,报告如下.
关键词： DNA引物 DNA 模板 聚合酶链反应 随机扩增多态DNA技术 -
应用PCR技术快速鉴定申克孢子丝菌的实验研究
采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,用申克孢子丝菌种特异性引物分别对21株申克孢子丝菌的基因组DNA进行PCR扩增.成功提取21株申克孢子丝菌基因组DNA,并用申克孢子丝菌种特异性引物分别从21株申克孢子丝菌基因组DNA中获得长度为320 bp的扩增产物.以申克孢子丝菌特异引物为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌简便、快捷、特异,可用于临床诊断.
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蠕形螨ISSR-PCR的反应体系优化及引物筛选
目的 以蠕形螨的DNA为模板,对蠕形螨简单重复序列锚定PCR (ISSR-PCR)反应体系优化并对ISSR引物进行筛选,为ISSR分析奠定基础.方法 用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因组DNA提取试剂盒提取山羊蠕形螨DNA,并以此为模板,以(CA)8RG(R为1分子的嘧啶)为引物,利用正交实验法,从Mg2+浓度、引物用量、dNTPs、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶以及退火温度对蠕形螨ISSR-PCR反应体系进行优化,并以优化的反应体系筛选ISSR-PCR的引物.结果 ISSR-PCR 25 μL佳反应体系包括:0.4 mmol/L Mg2+、30 pmol引物、30～60 ng模板DNA、2u Taq酶,佳退火温度为49℃、循环35次.筛选出10条条带清晰、多态性好、重复性高的引物.结论 筛选出蠕形螨ISSR-PCR佳反应体系和理想的引物,为蠕形螨的分子生物学研究奠定了基础.
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通用引物PCR研究进展
通用引物PCR是应用与不同序列的保守区互补的通用引物,来进行PCR扩增,它能够高通量地对相关微生物或其亚型进行检测与鉴定分型,是一种简便、快速、灵敏、特异的鉴定分型方法,目前广泛应用于病毒、细菌、支原体及真菌等微生物的检测与鉴定.
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聚合酶链反应技术检测申克孢子丝菌的实验研究
目的研究申克孢子丝菌的种特异性引物聚合酶链反应鉴定方法,从而为临床孢子丝菌病的分子诊断奠定基础.方法采用根据申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列设计合成的一对寡核苷酸引物,分别对26株申克孢子丝菌(包括1株标准株,7株实验室保存株,18株临床分离株)及6种6株普通真菌(分属于3个菌属)的基因组DNA进行PCR扩增.结果扩增产物选择性的从26株申克孢子丝菌基因组DNA中获得,而对念珠菌属、毛癣菌属、小孢子菌属的6株普通真菌基因组DNA均为阴性.结论采用以申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌特异、简便、快捷,可用于临床诊断.
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人RHD基因结构研究及意义
目的: 研究RHD基因结构,重点检测启动子区,探究RHD基因的表达机制. 方法: 采用PCR-SSP方法,设计3对序列特异性引物,对60例无血源关系RhD(+)汉族人样本、98例无血源关系RhD(-)汉族人样本和2例弱D 型汉族人样本RHD基因启动子区约1000 bp范围内的4个RHD基因特异性多态性位点进行检测. 结果: RhD表型(-)/RHD基因型(-)个体启动子区全缺失,表型RhD阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体启动子区都不缺失. 结论: RhD表型(-)/RHD基因型(-)个体符合RhD阴性的普遍机制,表型RhD阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体存在另一种RhD阴性机制.
