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核酸适体的研究进展
目录一、指数富集配体系统进化(SELEX)技术的基本原理及技术路线二、核酸适体的特点及优势三、核酸适体的应用(一)基础研究方面(二)诊断学方面(三)药物研制方面四、结语与展望近年的研究表明,DNA和RNA不仅起遗传信息储存和传递的作用,还可以藉自身形成的空间结构与其它类型的分子相互作用,以此为基础建立随机寡核苷酸文库,施加选择压力(结合靶目标),淘选与靶目标高度特异结合片段的过程,被称为指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术.筛选出的分子被称为核酸适体(aptamer).Aptamer源于拉定语aptus,即配对、适应之意.自1990年Tuerk等首次利用SELEX技术成功筛选到噬菌体T4DNA聚合酶的RNA型适体[1]以来,截止到2004年6月8日,据Aptamer Database网站[2]报道,各个实验室通过该技术已成功筛选出了2882种核酸适体,许多申请专利保护的适体序列还未计其中.核酸适体的靶分子广、亲和力高、特异性强、易改造修饰等特点令其在基础研究、临床诊断、药物研制方面得以广泛应用.
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克雷伯菌属噬菌体LH-01的生物学特性及其对败血症小鼠疗效的初步研究
目的 自地下生活污水中分离肺炎克雷伯菌的噬菌体,明确其生物学特性,观察其对小鼠多重耐药肺炎克雷伯菌所致败血症的疗效. 方法 电镜观察LH/01形态,调查其噬菌谱、生长曲线等生物学特性.建立小鼠败血症感染模型,观察LH-01的疗效. 结果 LH-01在其宿主菌的菌苔上形成毒性噬菌体所具有的完全透明的噬菌斑,电镜观察LH-01具典型的有尾噬菌体目短尾病毒科病毒的形态特征.一步生长曲线显示LH-01的潜伏期约为10 min,裂解量约为100 PFU/细胞.稳定性试验显示LH-01在pH 5～10及50 ℃和60℃环境均具良好稳定性.LH-01治疗克雷伯菌感染败血症小鼠的存活率为90％,对照组存活率为0,差异有统计学意义(P＜0.001),且无毒副作用. 结论 LH-01具有高效的裂菌活性和高稳定性,治疗克雷伯菌感染小鼠败血症有效且安全,有望成为生物抗菌剂,其有效成分有待进一步研究.
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粘质沙雷菌毒性噬菌体PS4的生物学特性及其在小鼠血清中的杀菌作用研究
目的 研究粘质沙雷菌毒性噬菌体PS4的生物学特性及其在小鼠血清中的抗菌活性.方法 观察PS4的噬菌斑及电镜下形态;测定PS4的噬菌谱、生长曲线及其理化稳定性,PS4在营养肉汤培养基、新鲜小鼠血清和灭活小鼠血清中的杀菌作用,以及小鼠血清中影响PS4杀菌能力影响因素.结果 PS4为长尾型噬菌体,在以粘质沙雷菌临床株S4为指示菌时,PS4可形成直径为1～1.5 mm完全透明噬菌斑,其感染S4的潜伏期为10 min,暴发量约为100 PFU/cell,且S4对PS4的抗性突变率仅为10-7.PS4在pH 5～10的环境中具有较好的稳定性,在50℃的环境中仍能长时间保持活力.PS4在新鲜未灭活血清中对S4不具杀菌能力,但在56℃热灭活30 min的鼠血清中以及在营养肉汤中的杀菌率均达99.99％,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PS4具有一定的酸碱稳定性和热稳定性,有望用于医院环境“消毒”,以减少多重耐药粘质沙雷菌所致的院内感染的发生.但因其杀菌作用受血清中不耐热成分的严重干扰,故不能用于治疗由S4引起的小鼠全身感染.
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血清不耐热物质对噬菌体PL39杀灭铜绿假单胞菌的影响
目的 观察人血清和鼠血清中不耐热物质对噬菌体PL39杀灭不同克隆铜绿假单胞菌的影响. 方法 采用双层平板法筛选PL39敏感宿主菌;根据ERIC-PCR图谱分析敏感宿主菌的遗传差异性.分别添加新鲜及热灭活人血清和鼠血清,观察其对PL39杀灭不同敏感宿的影响. 结果 筛选到9株PL39敏感宿主菌,其中2株菌ERIC指纹图谱无明显不同,其他菌株的指纹图谱明显不同.9株菌均能完全抵抗人血清和鼠血清的溶菌作用;噬菌体PL39在两种血清中均能保持恒定的成斑活性,但在人血清中对9株宿主菌的杀灭作用均被抑制;在小鼠血清中,PL39对L39菌有一定杀灭作用,对其他宿主菌无杀灭作用;两种血清热灭活(56℃,30 min)后对PL39杀灭不同宿主菌作用无显著影响,与营养肉汤中的PL39杀菌作用相比差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 人血清和鼠血清中的不耐热物质均可影响噬菌体PL39对其宿主菌的杀灭作用.
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大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究
目的 通过分离鉴定大肠埃希菌噬菌体,研究其生物学特性. 方法 利用噬菌斑法从环境污水中分离和鉴定大肠埃希菌噬菌体,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;提取噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线. 结果 通过噬菌斑法分离出9株大肠埃希菌噬菌体.电镜显示,噬菌体头部呈立体对称,有一长尾.琼脂糖凝胶电泳显示,噬菌体基因组大小约30 kb.生长曲线表明噬菌体感染宿主菌的潜伏期为23 min,爆发时间为39 min,裂解量为78. 结论 9株大肠埃希菌噬菌体中有6株具有较广的噬菌谱,潜伏期短,裂解量明显,为深入研究大肠埃希菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据.
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阴沟肠杆菌裂解性噬菌体Pyg1生物学特性及补体对其杀菌作用的研究
目的 明确阴沟肠杆菌噬菌体Pyg1的生物学特性及补体对其杀菌作用的影响.方法 电镜观察Pyg1形态,分析Pyg1噬菌谱、生长曲线及理化稳定性;比较Pyg1在不同补体活性血清中与阴沟肠杆菌临床分离株YG7作用1h后存活的细菌数.结果 Pyg1为肌尾型噬菌体,其感染YG7的潜伏期为20 min,爆发量为100 PFU/cell.Pyg1在pH5～9的环境中具有较好的稳定性,在50℃的环境中活性也无明显变化.Pyg1在56℃、30 min热灭活的鼠血清中和在营养肉汤中均具较强的杀菌能力(P＞0.05),存活细菌数＜ 100 CFU/ml.但在新鲜未灭活鼠血清和补体活性为25U/ml的液体中对YG7的杀菌能力减弱,存活细菌数＞105 CFU/ml.当补体活性超过50 U/ml时,Pyg1完全失去对YG7的抗菌活性,存活细菌数与无噬菌体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),均达107 CFU/ml以上.结论 Pyg1是一株裂解性噬菌体,在自然条件下其杀菌作用强且稳定,故在减少医院环境中对其敏感的多重耐药阴沟肠杆菌方面有潜在的应用前景.但因Pyg1对YG7的杀菌作用受血清中不耐热物质补体的干扰,因此不适于治疗YG7引起的全身感染.
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分枝杆菌噬菌体D29 holin基因的克隆及其编码蛋白的生物信息学分析
目的 研究分枝杆菌噬菌体D29 holin基因编码蛋白的理化特点及生物学特性,分析噬菌体抗结核菌的潜力.方法 根据GenBank中登录的分枝杆菌噬菌体D29 holin基因序列设计上、下游引物,以分枝杆菌噬菌体D29基因组为模板,PCR扩增holin基因,构建重组质粒pET32a-holin,进行双酶切鉴定、测序鉴定及生物信息学分析. 结果 PCR扩增得到序列正确的holin基因产物并成功构建重组质粒pET32a-holin.进化分析显示分枝杆菌噬菌体D29 holin基因与已知有尾分枝杆菌噬菌体Chy1、Chy4、Chy5 holin基因亲缘关系较近.生物信息学分析显示,该基因编码Holin蛋白为稳定、疏水性蛋白,具有2个跨膜区域和亲水性C-端;二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主,有信号肽,蛋白序列中存在2个丝氨酸磷酸化位点. 结论 分枝杆菌噬菌体D29 Holin蛋白的两个跨膜区及亲水性C-端构象发生变化,有助于阐明Holin“定时”打孔及启动噬菌体裂解细菌的机制,为研发抗结核Holin多肽药物奠定了基础.
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噬菌体PF23生物学特性及其对小鼠肺炎克雷伯菌全身感染疗效观察
目的 了解肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体PF23的生物学特性,观察其对小鼠全身感染的疗效. 方法 电镜观察噬菌体PF23的形态,一步生长曲线以及对温度和pH的敏感性;提取噬菌体基因组,酶切法鉴定其核酸类型,并初步估算其基因组大小;建立小鼠全身感染模型,观察PF23的治疗效果. 结果 PF23的噬菌斑为有晕清晰透明圆斑,直径约2 mm;电镜观察PF23具有尾噬菌体目,长尾病毒科病毒的形态特征;其在＜50℃的温度下及pH 4～9范围内稳定性好.一步生长曲线显示其潜伏期约为11 min,裂解量约为41 PFU/细胞.其基因组核酸不能被双链DNA限制性内切酶KpnI、EcoRI和HindⅢ切开,但能被BamHI切开,且酶片段大小合计＞27 kb.用PF23治疗由其宿主菌所致全身感染小鼠,小鼠的生存期均＞2 d,7d存活率为37.5％;未治疗对照组小鼠1d内均死亡. 结论 肺炎克雷伯菌的噬菌体PF23潜伏期短,有较好的热稳定性和酸碱稳定性,治疗小鼠肺炎克雷伯菌全身感染效果显著,值得进一步研究.
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鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ2生物学特性研究
目的 研究鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体ZZ2的生物学特性. 方法 电镜观察ZZ2形态,并研究其噬菌谱、生长曲线及稳定性等生物学特性. 结果 ZZ2可在3株鲍曼不动杆菌(AB09V,AB0901,AB0904)菌苔上形成裂解性噬菌体所具有的完全透明的滴斑区,其中AB09V是其敏感的宿主菌.电镜观察ZZ2具典型的有尾噬菌体目肌尾病毒科病毒的形态特征;一步生长曲线显示ZZ2感染AB09V的潜伏期为12 min,裂解量为(191±5)PFU/细胞.稳定性试验显示ZZ2在pH 4～9及50℃和60℃环境均具良好稳定性. 结论 噬菌体ZZ2能杀灭鲍曼不动杆菌,可作为生物抗菌剂使用.
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肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体PhF168的生物学特性其对重症败血症小鼠疗效的初步研究
目的 明确肺炎克雷伯菌噬菌体PhF168的生物学特性及其对小鼠重症败血症的疗效. 方法 电镜观察PhF168的形态,调查其噬菌谱并研究其一步生长曲线、温度和酸碱稳定性等生物学特性;提取PhF168的基因组,酶切鉴定其核酸类型,并初步估算其基因组的大小;建立小鼠重症败血症感染模型,观察PhF168治疗效果. 结果 PhF168可在宿主菌F168上形成直径3～5 mm、完全透明并带有较宽晕环的噬菌斑,为裂解性噬菌体.电镜下其颗粒呈有尾噬菌体目长尾噬菌体科的形态特征.PhF168的基因组为dsDNA,＞40 kb,含有EcoRⅠ和BamH Ⅰ限制性内切酶切位点.PhF168在宿主菌F168中的潜伏期为15 min,裂解量为(64±5)PFU/细胞,在pH 4～9和＜50℃下具良好稳定性.用PhF168治疗由其宿主菌F168感染所致的重症败血症小鼠,所有小鼠的生存期均在3d以上,7d存活率达40％.未治疗对照组小鼠1d内全部死亡. 结论 PhF168杀菌作用高效,具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,治疗宿主菌引起的小鼠重症败血症疗效显著,可作为治疗细菌感染的噬菌体候选株.
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19株新分离噬菌体可裂解肺炎克雷伯菌临床株的ERIC-PCR指纹图谱分析
目的 测定19株新分离噬菌体对30株肺炎克雷伯菌临床株的噬菌谱;对噬菌体可感染菌侏进行同源性分析以进一步评价其噬菌谱. 方法 利用滴斑法测定19株新分离噬菌体的噬菌谱:采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对噬菌体感染的菌株进行同源性分析. 结果 19株新分离噬菌体的噬菌谱可覆盖67％的被调查菌株(20/30).其中以噬菌体P13感染的菌株多,占33％(10/30),但这些菌株的ERIC-PCR分型仅归属于2种类型:Ⅰ型和Ⅵ型;噬菌体P27感染20％(6/30)的菌株,这些菌株的ERIC-PCR分型归属于4种类型:Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅷ型. 结论 根据肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指纹图谱分型信息,以噬菌体P27的噬菌谱较宽,可感染4种类型亲缘关系较远的肺炎克雷伯菌临床株.
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肺炎克雷伯菌噬菌体LH-02的生物学特性及基因组初步研究
目的 研究肺炎克雷伯菌噬菌体LH-02的生物学特性及基因组性质. 方法 观察LH-02的噬菌斑形态和电镜下形态;调查LH-02的噬菌谱,并观察其一步生长曲线以及理化稳定性;提取噬菌体基因组进行酶切鉴定. 结果 LH-02在宿主菌KF29菌苔上形成直径2～3 mm的透明噬菌斑,外周有宽2～3mm的半透明晕环;电镜观察确定其为有尾噬菌体目,短尾噬菌体科;一步生长曲线显示LH-02感染KF29的潜伏期短(约15 min),裂解量大(约217 PFU/细胞);LH-02在一个较宽的pH范围内(5～10)和较高的温度(50℃)范围内活性稳定;LH-02的核酸可被Kpn Ⅰ,EcoRⅠ,HindⅢ降解,但不能被BamH降解. 结论 LH-02为裂解性噬菌体,基因组为双链DNA,其潜伏期短,裂解量大,稳定性好,有望成为生物抗菌剂.
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6种常用消毒剂对28株噬菌体杀菌作用影响的研究
目的 观察84消毒液、双氧水、苯扎溴铵、石碳酸、碘伏和戊二醛等6种常用消毒剂对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌作用以及对28株噬菌体杀菌作用的影响. 方法 以上述3个菌株为指示菌,从城市污水中分离噬菌体;通过调查噬菌谱排除噬菌体克隆株,筛选出不同克隆株的毒性噬菌体;在双层培养基表面,通过观察不同消毒剂作用区域内噬菌斑形态和成斑率(EOP)的变化,分析6种消毒剂对28株噬菌体杀菌作用的影响. 结果 3种指示菌对84消毒液、双氧水、苯扎溴铵和石碳酸的敏感性不同(P＜0.05),其中铜绿假单胞菌对4种消毒剂均具有较强的抵抗能力.所有被调查的噬菌体中,杀菌作用不受6种消毒剂抑制的占25.0％ (7/28),其余噬菌体的杀菌作用均受消毒剂的影响.6种消毒剂中苯扎溴铵对噬菌体杀菌作用的抑制效果较强,抑制率为57.1％(16/28);而戊二醛的抑制作用弱,对28株噬菌体均无明显抑制作用.消毒剂影响噬菌体杀菌作用试验中,有20.8％(35/168)的反应受到明显抑制,明显增强的反应达50.6％(85/168),28.6％(48/168)的反应受消毒剂的影响不明显. 结论 6种常用消毒剂对噬菌体杀菌作用的影响随消毒剂和噬菌体的不同而不同,28株噬菌体的杀菌作用受6种消毒剂明显抑制的仅占少数.
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采用弓形虫T7噬菌体文库筛选黏附相关蛋白基因的研究
目的 用原代培养的猫肠上皮细胞(IECs)对已构建的弓形虫T7噬菌体展示文库进行筛选,期望得到将新的弓形虫入侵宿主细胞黏附相关蛋白基因. 方法 将猫IECs与混有噬菌体文库的DMEM培养基孵育培养后进行洗脱筛选,再与宿主菌BLT5403共同培养扩增文库,筛选噬菌体DNA并进行基因序列测定与分析. 结果 洗脱下的噬菌体滴度从第1轮7.6×105到第5轮的3.6×107,富集了230倍,非特异性结合和亲和力低的噬菌体被成功去除;核苷酸序列分析表明含插入片段为394 bp的噬菌体富集量大,经检索为弓形虫棒状体蛋白基因,是棒状体蛋白基因ROP2和ROP8的共有序列. 结论 初步证明弓形虫棒状体蛋白为黏附相关蛋白基因,其表达产物为ROP2.
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细菌Ⅵ型分泌系统概述
细菌Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是一种在结构和作用机制上与噬菌体尾部类似的细胞器,二者均通过与靶细胞直接接触转运效应蛋白.新研究表明,T6SS通过VipA/VipB鞘的收缩推动VgrG刺和Hcp管插入到靶细胞壁及细胞膜中,再通过Hcp管将抗菌及抗真核细胞效应子注入靶细胞,后以ClpV介导的ATP依赖途径恢复构象.本文对T6SS的结构、功能及调控的新进展进行综述.
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噬菌体PL39对铜绿假单胞菌L39感染小鼠的疗效观察
目的 通过体外试验观察噬菌体PL39对铜绿假单胞菌L39感染小鼠的治疗作用. 方法 小鼠腹腔注射L39菌液建立铜绿假单胞细菌L39所致小鼠重度感染模型,观察模型小鼠PL39治疗后的生存情况、健康状况并赋分;采用平板倾注法测定存活细菌数,测定PL39治疗组和对照组小鼠各组织脏器中PL39对L39的杀菌情况及PL39增殖情况;观察PL39在健康小鼠血清、热灭活健康小鼠血清、L39感染小鼠血清和热灭活L39感染小鼠血清中对L39菌的杀灭作用,测定不同血清中PL39对L39菌的吸附能力. 结果 小鼠腹腔注射总量108 CFU的L39菌建立铜绿假单胞菌重度感染模型,模型小鼠行尾静脉注射PL39治疗组的生存时间与无噬菌体治疗对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).治疗组模型小鼠各组织脏器及全血中活菌数和噬菌体数与无噬菌体对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).PL39在噬菌体治疗2h热灭活健康鼠血清、热灭活感染鼠血清、营养肉汤对照组中存活细菌数分别为4.57±0.25×102 CFU/ml,4.48±0.41×102 CFU/ml和4.60±0.43×102 CFU/ml,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05),与细菌对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);健康小鼠血清中的PL39杀菌作用与细菌对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),感染鼠血清中细菌数与细菌对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).感染鼠血清孵育1 min的L39被PL39吸附的活性显著降低,但灭活感染鼠血清或营养肉汤孵育后活性无显著影响(P＞0.05). 结论 PL39在健康鼠血清中对L39具有一定杀灭作用,但噬菌体的吸附作用可被血清中不耐热物质完全阻断导致其对由L39引起的小鼠全身感染治疗无效.
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抗人端粒酶蛋白亚基单域抗体制备和鉴定
目的研制抗人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白亚基单域重组抗体.方法以重组His-tag h TERT融合蛋白为抗原免疫小鼠,以逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)扩增小鼠脾细胞重链可变区;经克隆噬菌粒载体pCANTAB 5E及转染大肠杆菌建立噬菌体抗体展示文库, 经过亲和性富集选择阳性克隆,并于大肠杆菌(E.coli.HB2151)中表达为可溶性单域抗体; Western blot确定单域抗体结合特性.结果以RT-PCR扩增His-tag hTERT 免疫小鼠脾细胞RNA,得到35 0 bp小鼠重链可变区DNA片段;通过克隆及转染制备出噬菌体展示抗体文库, 文库大小是 8×104; 经过抗原-抗体亲和性筛选,得到4个克隆,并表达为可溶性单域抗体 (相对分子质量16 000) ;Western Blot分析显示:其中2个克隆的可溶性单域抗体可特异性结合His-tag hTERT融合蛋白(相对分子质量16 700),与His -tag无关;与人癌细胞表达的天然hTERT蛋白(相对分子质量127 000)分析亦显示其特异性结合能力.DNA序列分析证实可溶性单域抗体为小鼠抗体重链可变区VH基因编码.结论利用噬菌体展示技术已初步制备出小鼠重链可变区编码的抗hTERT蛋白的特异单域抗体,为进一步探索其抑制端粒酶活性及抗肿瘤作用奠定了基础 .
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人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点Fab单克隆抗体基因的获得
目的筛选人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因.方法根据HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点的氨基酸序列合成23肽,并以此为固相抗原从HIV-1噬菌体Fab抗体库筛选阳性克隆,并进行鉴定及序列测定.结果获得了1株抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点的人源Fab抗体克隆,具有较高的亲和力、特异性和抑制率,序列测定及分析显示该抗体属IgG Ⅰ亚类,κ型,重、轻链可变区分别属VhⅢ和VκⅢ基因家族.结论成功地获得了人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因.
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人源抗狂犬病毒基因工程单链抗体的研究
目的 研制人源抗狂犬病毒基因工程抗体.方法 从具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗接种者采集外周血淋巴细胞,通过pHAL14载体和高效噬菌体系统构建人源抗狂犬病毒单链基因工程抗体库,经纯化的狂犬病毒aG株富集筛选,通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果 成功地获得了6株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆抗体,非竞争ELISA显示6株抗体具有较高的亲和力,体外中和试验证实这6株人源单抗对狂犬病毒CVS株无中和活性,对aG株具有较强的中和活性.结论 从免疫库中获得了6株人源单克隆抗体,为狂犬病毒的鉴别诊断和治疗奠定了基础.
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HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体(ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径.方法采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCV NS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定.结果筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789 nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点.基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性.结论利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗体ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达.
