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RCA技术的应用及研究进展
滚环复制是噬菌体感染细菌后进行自我复制普遍采取的一种形式.这种复制形式可在同温下对环状单链DNA进行相对无限单链扩增.近年来在一些基因检测技术的研究中被广泛采用,并将与之有关的技术统称为滚环放大(rollingcircle amplification,RCA)技术[1].因为滚环复制的模板必须是封闭的单链环状DNA,许多研究者将这种特性用于单核苷酸多态性(SNP)及病毒基因检测和基因表达图谱等的研究中,还有一些实验直接将滚环的无限复制作为一种单纯的信号级联放大系统,并由此衍生出许多相关技术.本文综述了当前RCA技术及其相关的研究进展,并展望了该技术的应用前景.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec基因型及耐药谱研究
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)常引起医院感染的暴发流行.MRSA由于获得了外源性甲氧西林耐药决定子A(methicillin resistance determinant A,mecA),该基因编码青霉素结合蛋白2a,造成对所有β内酰胺类药物耐药.mec基因存在于葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)中,SCCmec是一种新型的可移动元件,不同于噬菌体和转座子,而且该元件还携带除mec4基因外的其他抗生素耐药基因,造成多重耐药.
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O139群霍乱弧菌染色体中整合两种CTXΦ前噬菌体基因组的多样性
目的研究同时携带两种CTXΦ基因组的O139群霍乱弧菌中CTXΦ基因组的多样性. 方法 Southern blot检测分离自福建的部分O139霍乱弧菌菌株中ctxAB和zot基因的多态性,然后选取ctxAB和zot基因拷贝数差异较大的3株菌,扩增其调控抑制基因rstR基因片段,克隆并进行序列测定、分析. 结果此3株菌染色体zot杂交条带多于ctxAB 2～5条,提示1个菌株染色体上有编码ctxAB的CTXΦ以及不编码ctxAB的CTXΦ两种基因组.以保守区设计的引物扩增此3株菌的rstR区,均得到2条大小不同的条带,分别克隆后进行测序,经GenBank同源性检索,发现在此3个菌株染色体中分别有来自El Tor型的CTXETΦ与不编码ctxAB的nct-CTXO139Φ、来自加尔各答型的CTXcalcΦ与nct-CTXO139Φ、以及CTXETΦ与新报道的一种具有独特rstR序列的CTXΦ类基因组两两共存于1个菌株染色体上.这3个菌株还具有不同的16S核糖体基因杂交图谱. 结论不同rstR序列的CTXΦ基因组可以共存于1个菌株染色体中,提示CTXΦ家族进化过程中的复杂分化,CTXΦ家族在不同霍乱菌株间的出现及传递、在霍乱弧菌菌株的变异分化中具有相关性.
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重组分枝杆菌噬菌体检测分枝杆菌活力的研究
重组的可表达荧光素酶的分枝杆菌噬菌体,由于可特异地感染宿主菌--分枝杆菌并在宿主菌中快速增殖,同时表达荧光素酶,因此通过检测荧光素酶的浓度即可快速检测分枝杆菌的活力.
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前脂蛋白乙二酰转移酶基因(lgt)与霍乱弧菌噬菌体VP3的受体相关
目的研究霍乱弧菌噬菌体VP3的受体相关基因,确定前脂蛋白乙二酰转移酶基因在霍乱菌株可被VP3感染中的作用.方法采用转座子(TnphoA)插入,筛选对VP3感染产生抗性的突变株.Southern blot鉴定突变株染色体中TnphoA的拷贝数,利用反向PCR扩增TnphoA插入位点旁侧研究菌株的染色体序列.对扩增产物测序确定插入位点基因.另外,克隆被破坏基因的完整序列,转入该突变株,以反式互补实验确定回补突变株对VP3的敏感性.结果获得1株VP3的抗性转座突变株,Southern blot确定TnphoA在其中为单拷贝插入,反向PCR(IPCR)扩增得到插入位点处的结构基因为霍乱弧菌lgt基因,其表达产物为前脂蛋白乙二酰转移酶(Lgt).反式互补表明突变株恢复了对VP3的敏感性.结论前脂蛋白乙二酰转移酶在赋予霍乱菌株噬菌体VP3的敏感性方面有重要作用,可能为VP3转染的受体合成中的必需酶类.
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铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其控制生物被膜的应用研究
目的 分离鉴定铜绿假单胞菌烈性噬菌体,研究噬菌体控制宿主菌形成牛物被膜的效率.方法 以铜绿假单胞菌临床菌株为指示菌,从不同环境样品中分离噬菌体;采用限制性内切酶图谱分析和宿主范围测定方法,对分离的噬菌体进行分类;利用透射电子显微镜对分离噬菌体进行形态学研究;以TJC729为指示菌,开展噬菌体控制牛物被膜形成的应用研究.结果 分别以14株铜绿假单胞菌临床分离菌株为指示菌,共分离得到13株烈性噬菌体,命名为C1～C13.利用限制性内切酶EcoR Ⅰ分析结果表明,13株噬菌体基因组均为双链DNA,并可被分成8组;宿主谱测定结果显示,c1和C13、C6和C7、C9和C11分别具有相同的宿主范围,其余7株噬菌体的宿主范围各不相同.随机挑选噬菌体C1进行形态学研究,发现噬菌体C1头部具有二十面体结构,尾部较长且无收缩性尾鞘,属于长尾噬菌体科.生物被膜控制实验结果显示,混合噬菌体能够较好地抑制TJC729生物被膜的形成.进一步实验结果显示,噬菌体C1、C10和C12分别与牛物被膜混合培养24 h后,牛物被膜的量分别下降到初始量的32.7%、57.6%、32.8%.结论 分离了13株铜绿假单胞菌烈性噬菌体,它们能够显著抑制宿主菌生物被膜的形成,并对生物被膜造成一定程度的破坏,为控制铜绿假单胞菌引起的感染提供了一个新方法.
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耐核糖核酸酶内含HCV RNA病毒样颗粒的表达
目的构建可以表达耐核糖核酸酶(RNase)的内含HCV RNA病毒样颗粒的载体质粒. 方法将表达载体pI NCCL用HindⅢ酶切后,与用相同内切酶酶切的HCV RNA非编码区(5′-UTR)扩增产物,在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR,再转化BL21-DE3 E.coli进行原核表达. 结果成功构建得到了新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR,经原核表达为耐RNase的内含HCV RNA病毒样颗粒. 结论得到的pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的构建和制备表达载体平台.
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应用噬菌体随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位
目的 探索利用特异多克隆抗体结合噬菌体递呈(phage display)随机肽库,进行病原体蛋白质的B细胞抗原表位研究.方法 采取特异抗原→特异多克隆抗体→相应抗原表位的技术路线.所选研究对象为丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白.实验分三步:(1)抗HCV核心蛋白多克隆抗体的制备.用活化的Sepharose 4B耦联重组的HCV核心蛋白,亲和层析纯化丙型肝炎病人血清中特异的抗核心蛋白多克隆抗体.(2)随机肽库的生物淘洗(biopanning).以纯化的多克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机七肽库.(3)阳性噬菌体克隆的鉴定.将筛选的噬菌体克隆进行ELISA检测、DNA测序以及竞争抑制试验等,后分析所获资料.结果 七肽氨基酸序列分析表明,HCV核心蛋白存在着至少3个B细胞抗原位点,其中19～25aa间(PQDVKFP)的线性表位是该蛋白的优势表位,证实了本研究策略的可行性.结论 本技术路线可以有效地进行HCV核心蛋白的B细胞抗原表位研究.由此推论,此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究,继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据.
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黄病毒属病毒的感染性克隆研究进展
黄病毒科包括了一大类人和动物的病毒性病原体,这些病毒均为包膜的单股正链RNA病毒,目前分三个属:经典的黄病毒属、瘟病毒属和丙型肝炎病毒属.每个属中病毒的感染性cDNA遗传学研究都使人们进一步了解病毒复制和致病性原理.对RNA病毒进行反向遗传学研究的历史,可追溯到20多年前,1978年Taniguchi首次从cDNA克隆获得了RNA噬菌体Qβ[1],1981年通过脊髓灰质炎病毒cDNA首次获得动物病毒的感染性克隆[2],从此对正链RNA病毒的反向遗传学研究系统逐步完善起来了.随后,对负链RNA病毒、分节(流感病毒)和不分节(狂犬病毒)的cDNA感染性克隆研究也获得成功.近对双链RNA病毒的反向遗传学研究也有了突破,至此,对RNA病毒的反向遗传学研究已涵括了大部分的RNA病毒.这些研究结果为疫苗开发研制提供了新途径.本文就黄病毒属病毒感染性克隆研究的技术方法和进展作一综述.
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cagA和cagM在中国人群感染幽门螺杆菌中的检测
cag致病岛(cag pathogenicity island)为新近在cagA表达阳性的幽门螺杆菌(Hp)菌株中发现的又一致病相关的基因群,其编码蛋白被认为是毒素及毒素转运机能相关的分泌系统.cag致病岛被认为是由水平转移的方式来源于质粒或噬菌体,具有部分或全部丢失等不稳定性表现.
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噬菌体治疗实验性小鼠耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的研究
目的探讨噬菌体治疗耐药性铜绿假单胞菌感染的疗效.方法以BALB/c小鼠为实验动物,建立耐药性铜绿假单胞菌全身感染模型,应用体外试验所筛选的宽噬噬菌体进行治疗.结果噬菌体在感染复数(multiple of infection,MOI)≥0.01时能有效杀灭铜绿假单胞菌,显著提高小鼠生存率.延迟治疗3 h仍有40%的生存率.结论通过对小鼠生存率、噬菌体在体内分布及机体对噬菌体的免疫反应等指标的观察分析,噬菌体制剂简捷高效,对机体正常组织无毒副作用,从而为临床治疗全身或局部铜绿假单胞菌感染提供了新途径.
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用噬菌体抗体库分离NK细胞抑制受体特异性的ScFv片段
目的 探讨从噬菌体抗体库分离杀伤细胞抑制受体(KIRs)特异性ScFv(singlechain Fv)的可行性及其特征.方法 所用KIR为NKAT2,其可溶性形式为NKAT2-IgG1.噬菌体抗体库为Nissim等报道的半合成抗体库.抗体库经包被免疫管的NKAT2-IgG1 5次筛选后,可溶性ScFv由IPTG诱导细菌而获得,筛选效果由测定噬菌体的菌落形成单位及DNA酶切图谱分析.ELISA、聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析ScFv特异性及免疫学特征,并进行DNA的序列测定.结果 5次筛选后,噬菌体得到200倍的富集,酶切图谱也显示某种构型噬菌体的富集.40个克隆的细菌上清经测试,37个显示与NKAT2有较强的反应.ScFv经聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示相对分子质量为30×103,其DNA序列完全相同,重链CDR3区编码氨基酸为ESNLVTC,重链其它部分与DP35一致.结论 研究初步结果表明,用噬菌体抗体库可以快速、简便地产生用于KIR研究的较高特异性的试剂.
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人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表达
目的 为了获取人源性HFRS基因工程抗体.方法 直接从人体PBL构建人全套ScFv、VH噬菌体表面呈现文库,以panning方法筛至四级文库,以ELISA方法鉴定各克隆抗汉坦病毒活性.结果 获得了14个ScFv阳性克隆和11个VH阳性克隆.其中ScFv高阳性克隆A410值为0.44, VH高阳性克隆A410值为0.50.对高阳性克隆进行了测序分析,证明连接和克隆正确,获得了抗HTV人源性ScFv和VH抗体的基因片段.克隆再转化于HB2151 菌株,成功地进行了分泌型抗体片段的表达.结论 采用噬菌体抗体库技术直接从人体克隆人源性汉坦病毒噬菌体抗体可行,对HFRS的防治有一定的实际意义.
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1例新生儿金葡菌性烫伤样皮肤综合征的护理
金葡菌性烫伤样皮肤综合征(Staphylococcal Scalded Skin Syndrome SSSS,简称4S)是一种发生于婴幼儿严重的急性感染性皮肤病[1],但在新生儿出生时发生极为少见,其致病菌是凝固酶阳性的噬菌体Ⅱ组金葡菌,此菌产生一种可溶性毒素,造成大面积皮肤损伤[2].我科于2001年4月收治了1名新生儿4 S患儿,经诊断、治疗和精心护理,得到较好效果.
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噬菌体裂解法与TaqMan-PCR法检测结核分支杆菌的比较
目的:比较研究噬菌体裂解法与TaqMan-PCR法在结核分支杆菌快速检测中的价值.方法:用噬菌体裂解法和TaqMan-PCR法检测3株结核分支杆菌标准株、13株非结核分支杆菌和7株非分支杆菌以及245份肺结核患者的痰标本、128例结核性胸膜炎胸腔积液、49例非结核性痰标本.结果:噬菌体裂解法:3株结核分支杆菌标准株均为阳性,而13株非结核分支杆菌和7株非分支杆菌、49例非结核性痰标本均为阴性;应用噬菌体裂解法和TaqMan-PCR法检测245份肺结核患者的痰标本的阳性率分别为46.9%和51.0%,二者差异无显著性(P＞0.05).两种方法检测128例结核性胸膜炎胸腔积液阳性率分别为40.6%和42.2%,二者差异无显著性(P＞0.05).结论:噬菌体裂解法简便、快速,具有较高的敏感性和特异性,是一种崭新的结核分支杆菌快速检测方法.
关键词： 噬菌体 分支杆菌 结核 TaqMan-PCR -
耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
目的为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供1个通用载体平台.方法将MS2噬菌体基因组中成熟酶蛋白和包膜蛋白基因编码序列的1.7 kb cDNA目的片段,用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后,用于相同内切酶酶切的表达载体质粒pET28b中,并在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL,再转化BL21-DE3 E.Coli进行原核表达. 结果成功构建出新的表达载体pI NCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒. 结论本研究得到的pI NCCL表达载体及原核表达系统,可作为1个耐RNase的RNA标准品与质控品的构建和制备表达通用载体平台,以促进有关标准品和质控品的研究.
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噬菌体模拟抗原替代亲环素A在测定自身抗体中的应用
目的探讨噬菌体展示肽库来源的模拟抗原替代重组人亲环素A(rhCyPA)在测定自身免疫病人血清抗亲环素自身抗体中应用价值.方法以抗人亲环素A 单克隆抗体(McAb)D4和E6作捕获抗体对噬菌体展示肽库进行淘筛,通过序列测定推断出模拟抗原氨基酸序列.再以筛出的模拟抗原包被微孔板,与重组人亲环素A抗原进行对比,用ELISA法检测系统性红斑狼疮患者血清抗亲环素自身抗体.结果从12肽库淘筛出的10个噬菌体克隆中9个共有一致氨基酸序列HWEYTTSPHPRL.56例SLE患者血清用12肽模拟抗原的ELISA测定,CyPA自身抗体阳性率为50%(28/56),用rhCyPA作包被抗原测定阳性率为43%(24/56);两法检测34例其他自身免疫病的阳性率均为11%,两法结果符合率为95.6%.通过试验比较,12肽模拟抗原用于检测CyPA自身抗体优于重组抗原和7肽模拟抗原.结论用抗CyPA单克隆抗体从噬菌体展示肽库淘筛出的特异12肽能模拟亲环素A抗原表位信息,可以代替亲环素A用来检测其自身抗体.
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用噬菌体模拟抗原检测白念珠菌菌丝蛋白抗体的研究
目的用噬菌体展示文库技术制备白念珠菌菌丝蛋白模拟抗原,建立测定白念珠菌抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA).方法用抗白念珠菌菌丝蛋白P47的单克隆抗体从噬菌体随机12肽库中筛选能与之免疫学结合的肽,即模拟抗原表位.将该模拟抗原包被微孔板,用于酶联免疫吸附测定法测定病人血清白念珠菌菌丝蛋白抗体.结果用噬菌体模拟抗原建立ELISA,其敏感性、特异性及重复性良好,测定了10份确诊白念珠菌侵袭性感染的病人血清,全部阳性,与用纯化的菌丝蛋白抗原P47测定结果一致;服用免疫抑制剂患者血清阳性率33%,健康人群阳性率为2%.结论用抗白念珠菌菌丝蛋白单克隆抗体从噬菌体展示随机肽库筛到的噬菌体模拟抗原可代替白念珠菌P47抗原进行抗体测定.
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应用微孔噬菌体扩增法检测结核分枝杆菌对利福平的敏感性
目的应用并评价微孔噬菌体扩增法(micro-well phage replication assay,MPRA)快速检测临床结核分枝杆菌分离株对利福平的敏感性.方法将适当浓度的利福平溶液作用于结核分枝杆菌临床分离株,一定时间后,加入噬菌体悬液.应用MPRA法检测利福平药物的敏感性.结果应用绝对浓度法对利福平敏感的42 株菌株中38株MPRA法敏感;绝对浓度法对利福平耐药的131株菌株中124株MPRA法耐药.MPRA法与绝对浓度法的符合率为93.6%(162/173),与绝对浓度法相比,MPRA 法的敏感度为94.7%(124/131),特异度为90.5%(38/42).结论 MPRA法不失为一种快速检测结核分枝杆菌对利福平敏感性的较好方法.
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噬菌体宿主谱改变核酸分析研究
目的探讨一种高效提取RNA噬菌体核酸的新方法,并通过核酸分析从基因水平了解宿主谱改变对噬菌体核酸的影响.方法采用传统的聚乙二醇(PEG)沉淀-蛋白酶消化-酸性酚提取法、Tripure 提取法以及抗体沉淀-盐酸胍一步法3种方法分别提取大肠埃希菌f2噬菌体及其宽宿主谱株的RNA,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度.采用兼并引物逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及随机引物随机扩增多态性DNA 聚合酶链反应(RAPD-PCR)比较分析噬菌体宿主谱改变前后其核酸序列组成的变化.结果抗体沉淀-盐酸胍一步法提取的噬菌体核酸具纯度高、条带完整等优点;f2噬菌体及其宽噬株均为6 000 bp左右的单链RNA噬菌体;两噬菌体基因cDNA扩增出的RAPD-DNA片段差异明显,其中26条为可区分的DNA带型;噬菌体f2 cDNA在450 bp附近出现重复性较好的扩增片段,而其宽噬株cDNA在相同条件下未出现扩增产物.结论抗体沉淀-盐酸胍一步法较其他两种RNA病毒核酸提取法具有明显的优势,具有应用价值的新的RNA噬菌体核酸的提取方法;宽宿主谱噬菌体的宿主特异性裂解效应已从基因水平发生了变化.
关键词： RNA 噬菌体 逆转录聚合酶链反应 随机扩增多态DNA技术
