407绿色毛状根的光合活性:质体超微结构以及叶绿素和次生代谢物的相关性

丹参植株原位侵染RNAi毛状根体系的建立及其干扰效果

目的:利用土培植物进行原位侵染获得RNAi型丹参毛状根,并对其干扰效果进行研究.方法:利用转化有目标基因RNAi载体的发根农杆菌对土壤中生长的丹参幼苗根茎部分进行侵染产生毛状根,经荧光显微镜鉴定阳性毛状根,并利用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达情况.结果:在土培丹参根茎部分成功侵染产生毛状根,利用荧光显微镜进行检测显示目标基因RNAi型毛状根阳性转化率为72.72%,RNAi空载毛状根阳性转化率为66.67%.实时荧光定量PCR结果表明RNAi型毛状根中目标基因表达受到抑制,表达量下降到空载型对照组的8.61%,证明对土培植物直接进行侵染能够成功诱导RNAi毛状根.结论:采用原位侵染法诱导丹参根茎部位成功产生阳性RNAi型毛状根,侵染过程无需无菌操作,简单快捷,对植株生长无影响,能够用于功能基因的体内功能研究.

不同元素对丹参毛状根生长及丹参酮类成分积累的影响

目的:研究不同浓度大量、微量、有机元素对丹参毛状根生长量及丹参酮类成分积累的影响.方法:以6,7一V液体培养基为基本培养基,分别将其大量、微量和有机元素的含量设定为缺失(O)、1/8、1/4、1(对照)、4、8倍,取培养相同时间的毛状根测定其增长倍数,利用HPLC法测定二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA的含量.结果:大量元素可显著影响丹参毛状根的生长和丹参酮类成分的积累.其中大量元素缺乏时可显著促进丹参酮类成分的积累,但其生长量受到明显抑制,而过量大量元素虽可在一定程度上提高生长量,但丹参酮类成分并无显著增长;微量元素和有机元素的改变对毛状根的生长和丹参酮类成分的积累无显著影响.结论:大量元素是影响丹参毛状根生长和丹参酮类成分积累的主要因素,大量元素缺乏(逆境)可显著促进丹参酮类成分积累,为毛状根培养及不同品质丹参形成机理研究提供了一定的基础.

流式细胞术测定丹参毛状根核DNA方法的建立

目的:建立丹参毛状根核DNA流式细胞术检测方法.方法:分别对内标物的选择、根组织核DNA分离方法以及测定方法的稳定性进行研究.结果:1)选择大豆核DNA作为内标物;2)丹参毛状根分离方法的特点是分离时间适量延长,且核DNA需要乙醇固定.3)重复性稳定.结论:该方法适用于毛状根核DNA的测定.

粘毛黄芩毛状根培养体系的建立及其黄芩苷的动态合成

目的:建立粘毛黄芩毛状根培养体系,并对其生长特性和次生代谢产物的合成进行初步探索.方法:采用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumofaciens C58C1感染粘毛黄芩无菌苗的茎段,获得毛状根,并得到了优质株系;测定了毛状根的生长曲线;利用PCR对毛状根进行T-DNA转化的检测及利用HPLC进行黄芩苷含量检测.结果:PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合入粘毛黄芩毛状根基因组中.C58C1感染粘毛黄芩无菌苗茎段8 d后,毛状根陆续在其伤口处产生,28 d时幼茎产生毛状根的外植体达81%.1/2 MS液体培养32 d后毛状根干重增加了17.42倍,总黄酮和黄芩苷含量分别增加了21.60,25.56倍.结论:粘毛黄芩毛状根离体培养的建立为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础.

丹参功能基因组学研究Ⅱ——丹参毛状根不同时期基因表达谱分析

目的:研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱,发掘丹参功能基因.方法:通过比较不同时期丹参毛状根的生长量和次生代谢产物含量确定用于cDNA芯片杂交的材料.采用间接标记法进行探针标记后进行杂交反应,GenePix Pro 4.0软件对芯片图像进行分析,数据用Lowess方法进行归一化处理.采用两倍差异标准结合T检验来确定差异表达基因.Northern点杂交检验4个基因与芯片杂交结果的一致性.差异基因单向测序后经过gap4软件拼接聚类,然后利用BLASTX,BLASTN进行比对分析,利用Gene Ontology和KEGG进一步预测基因的功能.结果:30～45 d为丹参毛状根的快速增殖期,45～60 d为丹参次生代谢产物的快速积累期.将45,60 d丹参毛状根分别与30 d材料进行杂交,得到203个差异基因.4个基因Northern点杂交的结果与芯片杂交结果一致.测序后得到172条EST,拼接聚类后形成114个Unigene,其中功能已知基因62个,功能未定的假想蛋白34个,相似性较低的未鉴定基因9个,无显著相似性的基因9个."GO"分类中67个基因得到注释,KEGG分析中74个基因得到注释,26个有详细的代谢途径分析.结论:得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素P450、二萜合酶等基因片段,为深入开展丹参功能基因组学研究提供了基础.

杜仲毛状根培养条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的研究

目的:诱导杜仲毛状根的发生及筛选优良毛状根系.方法:利用发根农杆菌C58C1诱导杜仲不同外植体产生毛状根,并利用HPLC测定桃叶珊瑚苷含量.结果:采用杜仲无菌苗胚轴经菌液浸染20 min,共培养3 d可得到佳转化效果.液体培养的生长量优于固体培养,有利于毛状根生物量和药用成分的积累,并筛选到桃叶珊瑚苷高产根系E_1.结论:可通过毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分.

长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究

目的:建立长春花毛状根转化体系,从毛状根中获得生物碱.方法:用发根农杆菌A4和R1000菌株分别感染长春花的不同外植体获得毛状根,并对毛状根的培养条件进行优化.结果:采用A4感染叶片,分别预、共培养2 d及添加100 mg·L-1的乙酰丁香酮(As)可得到佳转化效果,毛状根的诱导率达86.25%.以蔗糖为碳源及以水解乳蛋白为氮源的1/2MS培养基为毛状根的佳生长条件.检测结果表明,毛状根中的总生物碱含量高于长春花的原植株和愈伤组织.结论:可通过毛状根的培养来获得抗癌生物碱长春碱和长春新碱等.

甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响

目的:研究甘草毛状根的诱导及外界因子对其生长的影响.方法:用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes LBA9402和R1601感染甘草Glycyrrhiza uralensis 外植体.结果:2种发根农杆菌均能诱导甘草产生毛状根,LBA9402比R1601表现出较强的对甘草的感染能力,下胚轴的转化率高于子叶.在WP培养基上毛状根生长快.光照对毛状根生长有抑制作用.毛状根中5种黄酮类化合物的总量比愈伤组织中高1.5倍,其中甘草查耳酮含量是愈伤组织中的15.5倍.结论:本实验所建立的甘草毛状根培养系统,为研究甘草毛状根大量培养生产黄酮类化合物奠定了基础.

掌叶大黄毛状根的诱导及其蒽醌类化合物产生的研究

目的:研究掌叶大黄毛状根的诱导及蒽醌类化合物的生产.方法:用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes LBA9402和R1601感染掌叶大黄外植体.结果:2种发根农杆菌均能诱导掌叶大黄产生毛状根,LBA9402比R1601表现出较强的对掌叶大黄的感染能力.毛状根单克隆DH7a(由R1601诱导)生长速度高于DH5a,DH5c(由LBA9402诱导),且明显比非转化根(NOR)快.DH5a中蒽醌类化合物以大黄素为主,DH5c则以大黄素甲醚含量高,DH7a中4种蒽醌--大黄酸、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚含量相近,非转化根中大黄酚含量高,而芦荟大黄素的含量在4种根中均较低.结论:本实验所建立的掌叶大黄毛状根培养系统,为研究大黄毛状根大量培养生产蒽醌类化合物奠定了基础.

决明毛状根化学成分研究

目的:研究决明毛状根的化学成分.方法:用发根农杆菌Agrobacteriwn rhizogenes 9402菌株从决明子叶外植体上诱导产生毛状根,在MSO液体培养基中大量培养获得.并采用色谱技术和波谱手段对毛状根的化学成分进行分离鉴定.结果:从决明毛状根95%乙醇提取物的醋酸乙酯部分分离鉴定了8个化合物,分别是白桦酯酸、大黄酚、大黄素甲醚、豆甾醇、1-羟基-7-甲氧基-3-甲基蒽醌、大黄酚-8-甲醚、大黄酚-1-甲醚和芦荟大黄素.其中芦荟大黄素是首次从决明毛状根中分得.结论:决明毛状根能合成与原植物相似的化学成分.

茉莉酸甲酯对丹参毛状根中丹参酮类成分积累和释放的影响

目的:研究茉莉酸甲酯(methy jasmonat,MI)对丹参酮类成分的积累和向培养基中的释放的影响.方法:6-7 V悬浮振荡培养ATCC15834农杆菌诱导的丹参毛状根培养18 d后,液体培养基中加入化学诱导子--茉莉酸甲酯,采用HPLC的方法,测定MJ处理后不同时间段(2,6,9 d)丹参毛状根中隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量以及其在培养基中的含量.结果:毛状根经MJ处理后2,6,9 d隐丹参酮的含量分别达0.039,0.204,0.572 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理的2.2,8.5,23.8倍;丹参酮ⅡA的含量达0.251,0.601,1.563 mg·g-1,分别是同时间期未经MJ处理丹参毛状根的1.9,4.1,6.2倍.结论:MJ能显著促进丹参毛状根中丹参酮类成分的积累并向培养基中释放.

川黄柏毛状根的诱导及活性成分的产生

目的:诱导川黄柏毛状根的发生.方法:利用发根农杆菌ATCC15834,A4,R1600和R1000诱导川黄柏不同外植体产生毛状根.结果与结论:经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中,HPLC测定结果显示,川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱,并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织.

何首乌毛状根生物转化对苯二酚生产熊果苷的研究

目的:利用何首乌毛状根悬浮培养体系生物合成熊果苷,并对转化条件进行考察.方法:利用何首乌毛状根培养体系对底物对苯二酚进行生物转化,通过HPLC制定熊果苷标准曲线,以转化产物熊果苷的产量和转化率为指标,研究了共培养时间、底物加入浓度、培养瓶体积对生物合成熊果苷的影响.同时考察了产物在培养基中的分泌情况.结果:产物在培养物和培养基中同时存在.熊果苷标准曲线Y=440 740X-1.473(r=0.999 7).当底物加入质量浓度为1 100 mg·L-1,共培养72 h时,熊果苷的产量(2.22 g·L-1)和转化率(81.45%)达到优.3 L大瓶培养获得成功.结论:本研究大大提高了以生物转化方法生产熊果苷的产量和转化率,并达到了3 L大瓶培养规模.此外,本研究也为利用生物技术方法大规模生产熊果苷提供了有价值的参考资料.

药用植物毛状根的诱导及其应用

植物毛状根培养是植物组织培养中的一种,因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足,且具有不依赖外源植物激素等优点,近年来研究较多.文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况,并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用,旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据.

催眠睡茄Withania somnifera毛状根的诱导及睡茄素A的合成

睡茄素A是存在于催眠睡茄的根和叶中的主要次生代谢产物之一.该实验以催眠睡茄的无菌苗叶片为外植体,利用发根农杆菌C58C1诱导催眠睡茄毛状根,诱导率达30％.同时,利用HPLC测定野生催眠睡茄植株的根、茎、叶和30d液体悬浮培养的毛状根中睡茄素A的含量结果表明,毛状根中睡茄素A平均质量分数为1.588 mg·g-1,是野生植株平均含量的1.96倍;其中,毛状根系M3的睡茄素A含量高,质量分数达到1.783 mg·g-1,是野生型催眠睡茄植株根含量的1.51倍.因此,可以培养催眠睡茄毛状根来获得睡茄素A.

茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根中主要莨菪烷类生物碱成分积累和释放的影响

目的:研究茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ)对曼陀罗毛状根中主要次生代谢产物东莨菪碱和莨菪碱成分的积累和向培养基中的释放的影响.方法:1/2 MS液体培养C58C1农杆菌诱导的曼陀罗毛状根培养18 d后,液体培养基中加入化学诱导子——茉莉酸甲酯,采用HPLC测定MJ处理后不同浓度梯度及不同时间段(0,3,6,9,12 d)曼陀罗毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的含量以及其在培养基中的含量.结果:曼陀罗毛状根经MJ处理后3,6,9,12 d的东莨菪碱的质量分数分别达0.419,0.439,0.431,0.374 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理的1.36,1.42,1.17,1.12倍；莨菪碱的质量分数达1.493,0.817,0.723,0.698 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理曼陀罗毛状根的2.28,1.11,0.63,0.70倍.结论:MJ能显著促进曼陀罗毛状根中东莨菪碱成分的积累并向培养基中释放；MJ能显著促进处理3d和6d后曼陀罗毛状根中莨菪碱成分的积累并向培养基中释放.

白花曼陀罗毛状根的诱导及东莨菪碱和莨菪碱的合成

目的:建立白花曼陀罗毛状根诱导和培养体系并对毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的动态合成进行初步研究.方法:以白花曼陀罗子叶为外植体,利用发根农杆菌C58C1诱导毛状根,测定白花曼陀罗毛状根的生长曲线及东莨菪碱和莨菪碱的动态合成曲线,利用HPLC测定不同毛状根单克隆系中东莨菪碱和莨菪碱的含量.结果:以野生白花曼陀罗的子叶为外植体,消毒后直接诱导毛状根,诱导率达70％,25 d液体悬浮培养的毛状根生物量积累及东莨菪碱和东莨胆碱含量达到高.获得高产东莨菪碱的毛状根系M2和高产莨菪碱的毛状根系M1,毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的积累效率分别是是野生白花曼陀罗叶片中含量的2.53,5.37倍.结论:白花曼陀罗毛状根诱导和培养体系的建立为实现东莨菪碱和莨菪碱的工业化大规模生产奠定基础.

ABA及其生物合成抑制剂对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响

目的:研究脱落酸(ABA)及其生物合成抑制剂氟啶酮(fluridone),对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响.方法:继代培养18d的丹参毛状根添加不同浓度的ABA及ABA与氟啶酮组合,处理1d后测定关键酶PAL和TAT活性；处理6d后测定不同处理的丹参毛状根中酚酸类物质的含量.结果:在一定浓度范围内,低浓度的ABA促进丹参毛状根的生长,高浓度的ABA抑制丹参毛状根的生长；ABA显著促进酚酸类物质的积累,对咖啡酸的诱导表现出正相关,但是迷迭香酸和丹酚酸B的效果,表现出在低浓度效果较好,随浓度增大,诱导效果降低,直到ABA浓度至200 μmol· L-1,含量开始上升；当ABA与氟啶酮组合处理时,氟啶酮抑制ABA对丹参毛状根酚酸类的积累,但是有差异；不同浓度的ABA会不同程度的提高PAL和TAT酶的活性,添加ABA生物合成抑制剂,酶活性诱导效果降低.结论:ABA能诱导丹参毛状根中酚酸类化合物积累,同时也能激活合成相关酶的活性；ABA生物合成抑制剂氟啶酮不同程度抑制ABA的诱导效果.

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系.方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400g·L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400g·L-1Cef+2.5 g·L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V +2.5 g·L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮Ⅰ的积累.结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3％；农杆菌侵染10 min诱导效率高为63.3％；共培养2～3d诱导效果好；PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性；丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系.结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础.