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细菌分离培养与实时荧光定量-聚合酶链反应用于健康人群脑膜炎奈瑟菌携带率研究
目的 了解河北省部分地区健康人群脑膜炎奈瑟菌(Nm)带菌状况,评价实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)作为菌株分离培养法的补充在健康人群带菌调查中的应用价值.方法 按年龄分层整群随机抽取577人采集咽拭子,采用Nm分离培养和FQ-PCR法同时检测,并使用血清学和分子生物学方法分群.结果 分离到18株Nm菌株,总阳性率3.12％,其中不可分群多(9株),其次为B群(3株)、W135群(3株)、X群(2株)、C群(1株).FQ-PCR检测阳性样本46份,总阳性率7.97％,其中B群多(13份),其次为W135群(12份)、不可分群(11份)、X群(7份)、C群(3份).结论 细菌培养和FQ-PCR均提示这些地区健康人群携带Nm血清群多样化.FQ-PCR检测方法在发现病原体及分群方面比传统菌株分离培养方法都有显著提升,可作为传统方法的有力补充.
关键词： 脑膜炎奈瑟菌 携带率调查 细菌培养 实时荧光定量-聚合酶链反应 -
氨基糖苷类药物耐药基因armA实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立
目的 建立一种快速、准确检测细菌中armA耐药基因的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,real-time PCR)方法.方法 根据armA基因设计特异的引物及探针,在多种常见致病菌中检测其特异性;使用阳性质粒标准品评价该方法的灵敏度;使用粪便模拟标本验证该方法的应用性.结果 本方法特异性好,建立的armA耐药基因real-time PCR方法标准曲线,确定其对质粒标准品的灵敏度为4.07×101拷贝/ml.应用该方法对粪便模拟标本进行检测,其检测下限为1.3×104cfu/ml.结论 本研究建立了armA耐药基因荧光定量PCR检测方法,有望在耐药基因监测中推广使用.
关键词： armA基因 实时荧光定量-聚合酶链反应 粪便模拟标本 -
利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌
目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中伤寒沙门菌的检出率.方法 根据伤寒沙门菌特异基因STY1633设计特异性引物,优化反应条件,建立实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应体系.利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证.结果 利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性.在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的低检测限为500fg/反应,相当于97个拷贝/反应.以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104 cfu/g,增菌后可达50 cfu/g.结论 基于STY1633基因的实时荧光定量PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持.
关键词： 伤寒沙门菌 实时荧光定量-聚合酶链反应 伤寒 -
TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立
目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持.方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法.对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较.结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3～5 cfu)提高了一个数量级.其检测标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999).用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100％.结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值.
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RT-PCR法检测不同部位胃镜活检样本中幽门螺杆菌感染及耐药性的意义
目的 应用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,分别对胃窦和胃体部进行幽门螺杆菌(Hp)鉴定及其对克拉霉素耐药基因突变检测,以了解同一患者不同部位Hp感染及耐药情况,更好地为临床用药提供指导.方法 选取60例功能性消化不良,且经14C呼气试验确诊Hp阳性的患者,经胃镜分别在胃窦及胃体部采样活检,采用RT-PCR方法对此120例标本Hp感染情况进行鉴定,随后对Hp阳性的标本进行克拉霉素耐药基因A2142G和A2143G突变情况检测.结果 120例标本中有116例Hp阳性,其中胃窦部56例(93.3％),胃体部60例(100％),有4位患者(6.7％)不同部位Hp感染的鉴定结果不一致.在116例Hp阳性标本中,48例(41.4％)为野生型,67例(57.8％)为突变型,1例(0.9％)同时存在野生型及A2143G、A2142G突变型.在67例耐药Hp中,47例为A2143G纯合突变,18例为A2143G杂合突变,2例为A2142G纯合突变.在56位胃窦和胃体Hp感染均为阳性的患者中,有7位患者(12.5％)不同部位Hp对克拉霉素耐药基因突变存在差异,主要为A2143G纯合与杂合突变间的差异(5/7),敏感与耐药间的差异(1/7),以及混合感染与单纯耐药间的差异(1/7).结论 使用RT-PCR方法将胃窦及胃体两个典型部位分别进行Hp相关检测,可提高Hp的检出率,且有助于正确判断Hp的存在部位以及耐药Hp的突变位点和类型,进而优化临床治疗方案,指导抗菌素的选择,从而提高Hp的根除率.
关键词： 幽门螺杆菌 克拉霉素 耐药性 实时荧光定量-聚合酶链反应
