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聚合酶链反应扩增STY3671基因鉴别伤寒与甲型副伤寒沙门菌
目的 评价伤寒沙门菌基因STY3671用于特异性检测该血清型沙门菌的可能性.方法 根据伤寒沙门菌与甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白质组比较得到的伤寒沙门菌特异性蛋白点编码基因STY3671的序列设计引物,提取伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌以及其他非伤寒沙门菌血清型菌株的基因组DNA进行PCR检测,对引物特异性和灵敏性进行分析.结果 检测的184株伤寒沙门菌均得到807 bp长度片段,部分菌株扩增产物测序结果与伤寒沙门菌标准株CT-18一致.146株甲型副伤寒沙门菌以及其余163株其他血清型沙门菌均未扩增出该片段.结论 STY3671基因能够作为特异性检测伤寒沙门菌的靶标,能够区别于甲型副伤寒沙门菌及其他常见非伤寒沙门菌血清型,在发热患者的伤寒沙门菌感染诊断、尤其使用血液标本检测中具有良好的潜在价值.
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中国六省伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳分析及数据库的建立
目的 对中国六省分离的伤寒沙门菌进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,初步建立中国伤寒沙门菌的数据库.方法 采用PFGE技术,对中国1979-2005年六省分离的伤寒沙门菌用Xba Ⅰ酶切,用BioNumeries软件对PFGE图谱进行分析,并且建立中国分子分型数据库.结果 收集的417株菌株共有288种不同的PFGE带型,相似性系数在55.2%-100%之间,不同的省份和年份之间有交叉带型.结论 中国伤寒沙门菌的菌株变异较大,不同的省份可能存在不同克隆系的伤寒沙门菌菌株的流行.通过建立中国伤寒沙门菌PFGE带型数据库,对中国以后伤寒沙门菌的监测具有重要的意义.
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2013年湖北省某高校一起伤寒暴发调查
2013年12月11日,湖北省仙桃市城郊某职业学院发生一起伤寒暴发疫情,至12月22日共报告74例病例,其中学生病例72例,罹患率为1.10％(72/6533).从食堂6名从业人员和4名帮厨学生血清中检出肥达反应伤寒沙门菌阳性,从69例患者血液中分离出24株伤寒沙门菌.调查结果显示暴发原因可能为食堂从业人员既往感染伤寒沙门菌,污染食堂相关环境导致患病学生多天数、多餐次、多窗口暴露引起.提示应进一步加强基层医疗机构传染病监测和早期预警,高度重视学校肠道传染病防控工作,重点加强食堂从业人员和学校卫生综合管理,严防"病从口入".
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基于微流控的核酸片段分离技术用于伤寒沙门菌MLVA分型的研究
目的 探讨和优化基于微流控技术的DNA片段分离技术用于伤寒沙门菌多位数目可变串联重复序列分析(MLVA)的方法.方法 制备与分析片段长度相似的内标来提高实验结果分析的重复性;用Agilent2100分析仪和序列测定技术分析伤寒沙门菌10个数目可变串联得复序列(VNTR)位点的PCR产物,比较2种方法的一致性,优化基于微流控的DNA片段分析技术.结果新内标能够提高方法的重复性;使用Agilent 2100分析仪电泳以及新内标校正片段后,具备相同重复单元拷贝数的VNTR扩增产物具有相同的电泳位置,通过序列测定证实了这些分析结果.结论 优化的基于微流控技术的DNA片段分离方法能够提高短重复序列MLVA分析的准确性,可应用于伤寒沙门菌的MLVA分析.
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利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌
目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中两种病原的检出效率.方法 分别根据伤寒沙门菌特异基因STY1633及甲型副伤寒沙门菌特异基因SPA4289设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应(dual taqman fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)体系.利用44株伤寒沙门菌、30株甲型副伤寒沙门菌、88株其他血清型沙门菌染色体DNA及引起发热的其他病原菌,评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者、20份甲型副伤寒患者及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证.结果 利用本方法检测的伤寒、副伤寒沙门菌纯菌及伤寒、甲型副伤寒患者标本扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性.在对纯伤寒沙门菌DNA及甲型副伤寒沙门菌DNA检测中,双重TaqMan荧光定量PCR法的低检测限分别为1 pg/反应(194拷贝/反应)及2.5 pg/反应(485拷贝/反应).以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前伤寒沙门菌检测下限达102cfu/g,增菌后可达1 cfu/g;增菌前甲型副伤寒沙门菌检测下限达104 cfu/g,增菌后可达10 cfu/g.结论 本研究建立了特异性好、灵敏度高的检测粪便中伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,为伤寒及甲型副伤寒疾病的同时快速诊断及鉴别诊断、某些不明原因发热及腹泻症状的病原的初步鉴定提供了简易手段.
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利用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法检测血液中伤寒沙门菌
目的 建立实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction,rRT-PCR)方法检测伤寒沙门菌.方法 针对伤寒沙门菌STY1631基因设计特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的rRT-PCR方法,利用51个血清型的纯培养伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌核糖核酸(RNA)评价该方法的特异性及敏感性,同时对伤寒沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测.结果 利用该方法检测48株伤寒沙门菌均阳性,其余33种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌也均扩增阴性.在对纯菌总RNA检测中,rRT-PCR的低检测限为1 pg/反应,即194个拷贝/反应.以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达1×102 cfu/ml.结论 建立了敏感性高、特异性好的rRT-PCR检测血液中伤寒沙门菌的方法,为伤寒沙门菌感染的快速诊断及不明原因发热症状的病原初步鉴别提供了简便的手段,可用于对伤寒的早期诊断、预防控制及临床治疗.
关键词： 伤寒沙门菌 实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 检测 -
全血中伤寒沙门菌RT-LAMP检测方法的建立
目的 建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测伤寒沙门菌.方法 针对伤寒沙门菌fliC-d基因设计6条特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP方法,利用48个血清型的纯培养伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌RNA评价该方法的特异性及敏感性,同时对伤寒沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测,并与rRT-PCR方法的敏感性进行比较.结果 等温65℃条件下,30～60 min内可完成RT-LAMP检测反应,利用该方法检测44株伤寒沙门菌均阳性,除4种少见的非伤寒沙门菌血清型扩增阳性外,其余30种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌也均扩增阴性.在对纯菌总RNA检测中,RT-LAMP的低检测限为0.5 pg/反应,即97个拷贝/反应.在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达1 cfu/ml,比rRT-PCR检测低限高100倍.结论 建立了敏感性高、特异性好的RT-LAMP检测血液中伤寒沙门菌的方法,为伤寒沙门菌感染的快速诊断及不明原因发热症状的病原初步鉴别提供了简便的手段,可用于对伤寒的早期诊断、预防控制及临床治疗.
关键词： 伤寒沙门菌 反转录-环介导等温核酸扩增技术 伤寒 -
利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌
目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中伤寒沙门菌的检出率.方法 根据伤寒沙门菌特异基因STY1633设计特异性引物,优化反应条件,建立实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应体系.利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证.结果 利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性.在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的低检测限为500fg/反应,相当于97个拷贝/反应.以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104 cfu/g,增菌后可达50 cfu/g.结论 基于STY1633基因的实时荧光定量PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持.
关键词： 伤寒沙门菌 实时荧光定量-聚合酶链反应 伤寒 -
1995-2016年新疆维吾尔自治区伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳分子分型分析
目的 通过对新疆维吾尔自治区(新疆)1995-2016年伤寒沙门菌进行分子流行学特征分析,为今后监测和疫情预警提供依据.方法 利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对527株伤寒沙门菌进行分子分型和流行特征研究.结果 527株伤寒沙门菌分为145个PFGE带型,条带相似度为57.42％～100.00％.有部分带型多年持续存在,且出现在不同地区.共发现32组分子分型成簇性病例.结论 新疆伤寒沙门菌在基因型上存在高度多态性,同时也有优势带型长期连续存在,且存在分子分型成簇性病例,需要加强实验室监测.
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基于TaqMan探针四重荧光PCR检测甲型、乙型、丙型副伤寒和伤寒沙门菌
目的 建立基于TaqMan探针四重荧光PCR检测甲型、乙型、丙型副伤寒和伤寒沙门菌的方法.方法 根据甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A,SPA)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B,SPB)、丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi C,SPC)和伤寒沙门菌(Salmonella typhi,ST)的特异序列分别设计引物SPAP、SPBP、SPCP和STP,在探针的5'端分别标记TET、ROX、FAM、HEX,建立基于TaqMan探针四重荧光PCR检测方法.结果 SPAP、SPBP、SPCP和STP分别扩增出5株SPA、4株SPB、7株SPC和11株ST,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性.SPAP、SPBP、SPCP和STP扩增效率分别为84.5%、101.8%、92.4%和90.9%,线性相关系数(R2)分别为0.996、0.975、0.996和0.984.结论 建立的方法特异性高、敏感性强,可用于SPA、SPB、SPC和ST的特异性检测.
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广西306株伤寒沙门菌对抗菌药物的耐药性分析
伤寒、副伤寒沙门菌的耐药性研究是及时调整伤寒、副伤寒治疗策略的重要依据来源.全球每年伤寒发病约为1 600～3 300万例,死亡50～70万人.广西每年发病约在5 000例,局部地区发病率可高达400/10万,严重地影响着流行地区人民的身体健康.
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从健康体检饮食服务人员中检出一株伤寒沙门菌
2004年10月海珠区疾病预防控制中心微检室在饮食从业人员健康体检者肛拭标本中检出一株伤寒沙门菌.伤寒的健康带菌者较少被发现,由从业人员体检标本中检出该菌的报道也不多见.
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广西壮族自治区1994-2013年伤寒流行病学特征及菌株耐药分析
目的 分析1994-2013年广西地区伤寒流行特征、菌株耐药特征及其变迁.方法 采用描述流行病学方法分析1994-2013年广西地区伤寒疫情报告资料,对分离自伤寒病例475株沙门菌,利用纸片扩散法及肉汤微量稀释法检测抗菌药物小抑菌圈和抑菌浓度(MIC),依据CLSI 2012版敏感判定标准,判定菌株的耐药情况.结果 20年间广西地区共报告伤寒病例57 928例,年均发病率为6.29/10万,病死率为0.03％.＜20岁人群发病较高,发病无性别差异,病例以农民和学生为主,主要分布在广西北部地区,全年均有发病,发病高峰在5-10月.2001-2013年发生13起大的暴发疫情,传播方式以水型为主.475株菌对第三代头孢类抗生素头孢噻肟和氟喹诺酮类诺氟沙星的敏感率为100％,对四环素、氯霉素、氨苄西林、庆大霉素的敏感率约为98％,对环丙沙星的敏感率为89.89％;对链霉素、复方新诺明的敏感性较低,为67.73％和65.89％.发现1株环丙沙星耐药、47株环丙沙星敏感性降低的菌株.暴发株与散发株耐药情况无差别.有28株菌耐≥3种抗生素,首次发现1株同时对氨苄西林、氯霉素、链霉素、复方新诺明、四环素、萘啶酸(ACSSxT-NAL)耐药的多重耐药菌株.多耐药株多见于伤寒小范围暴发疫情.结论 广西地区伤寒发病水平仍较高,且菌株出现对临床常用的氟喹诺酮类药物敏感性降低及多重耐药现象,应加强疫情及耐药监测.
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贵州省伤寒沙门菌分离株16s核糖体基因型的多态性及其流行病学意义
目的探讨贵州省不同时间、不同地区伤寒流行菌株的遗传多态性及内在联系.方法利用southern杂交技术,对贵州省9个地 区26个县、市1959～1999年伤寒沙门菌分离株进行染色体DNA基因限制性酶切16s rDNA探针 杂交图谱分析及药物敏感性试验.结果分析发现选择的209株分属 26个RT型,以RT1和RT2为优势型;在局部发生伤寒流行时,均由独特RT型引起.耐药菌株以 RT7和RT1型为主.结论贵州省不同地区、不同时间的分离菌株在核糖体杂交图谱上有明显的多态性,分析认为具有多重耐药性以及存在众多克隆群菌株是引 起贵州伤寒发病率居高不下的主要原因.
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高渗应激早期伤寒沙门菌RpoE调节因子对基因表达的影响
伤寒沙门菌是一种革兰阴性肠道致病菌,常通过污染的食物进入体内,可造成严重全身性感染[1-2].作为食源性致病菌,必须遭遇人体消化道的高渗环境,但目前对其克服高渗应激的具体机制尚不清楚.RpoE调节因子由rpoE基因编码,是肠杆菌科细菌中一个重要的σ因子,在大肠杆菌响应高渗应激时发挥着重要的作用[3],在伤寒沙门菌中也应当十分重要.
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伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因的克隆及与上皮细胞的粘附作用研究
目的 克隆伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因,在大肠埃希菌中表达；了解伤寒沙门菌stg与人上皮细胞的相互作用. 方法 根据大肠埃希菌保守基因序列设计引物,克隆stg成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21 (DE3)中并观察与上皮细胞的粘附特性. 结果 成功克隆stg基因全长核苷酸序列,构建了pET32a/stg原核表达重组质粒.pET32a/stg重组质粒转化大肠埃希菌能较多出现在上皮细胞表面.结论 成功克隆并表达了伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因,stg基因能促进沙门菌对上皮细胞的粘附,为进一步了解伤寒沙门菌菌毛操纵子stg的特性与功能奠定了基础.
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短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡
目的 观察短链脂肪酸(SCFA)作用下伤寒沙门菌能否诱导巨噬细胞凋亡及其机制. 方法 将伤寒沙门菌及SCFA作用菌与巨噬细胞共孵育,于 2、4、8、12和24 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率,并于作用8 h后检测NO、TNF-α、caspase-3产生量,及加入TNF-α抗体和caspase-3抑制剂后的细胞凋亡率. 结果 SCFA作用下的伤寒沙门菌可诱导巨噬细胞凋亡,凋亡率与对照组及伤寒沙门菌原菌组比较差异有统计学意义(P＜0.01);作用8 h后NO、TNF-α、caspase-3的产生量均高于对照组(P＜0.01);加入TNF-α抗体后凋亡率明显降低(P＜0.01). 结论 SCFA作用下伤寒沙门菌可诱导巨噬细胞凋亡,其凋亡可能由活性氮及细胞因子 TNF-α介导和caspase-3参与.
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杭州地区伤寒及甲型副伤寒沙门菌流行菌株分子特征的研究
目的 了解并确定2002-2008年杭州地区伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌优势菌株的分子特征.方法 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点串联重复序列分析(MLVA)或多位点序列分型(MLST)对2002-2008年杭州地区分离的31株伤寒沙门菌、404株甲型副伤寒沙门菌进行分型并分析.结果 404株甲型副伤寒沙门菌可分为6个PFGE型,P1型和P2型属于同一个克隆系,99.0％ (400/404)菌株属于该克隆系,其中P1型菌株占该克隆系菌株的93.3％ (373/400).31株伤寒沙门菌株存在高度多样性,可分为14个PFGE型、28个MLVA型(分辨率90.3％)、3个MIST型.根据MLVA各型靶位点多态性差异,本地区流行的伤寒沙门菌株与东南亚地区菌株相近,但与欧洲菌株差距较大,呈高度多态性的可变串联重复序列(VNTR)位点TR1、TR2、Sal02可作为本地区伤寒沙门菌株的检测标志.伤寒沙门菌株MLST型别包括了目前国际上发现的所有3个型别,但以ST2型为主(23/31,74.2％).结论 近年杭州地区甲型副伤寒疫情由同一亚系菌株感染所致,但本地区流行的伤寒沙门菌株呈现高度多样性.
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多位点串联重复序列分析和脉冲场凝胶电泳对伤寒沙门菌基因分型
目的：比较多位点串联重复序列分析（ MLVA）和脉冲场凝胶电泳（ PFGE）对伤寒沙门菌基因分型的能力，构建适合伤寒沙门菌的MLVA分型方法。方法根据国外文献报道选出5个多变的伤寒沙门菌串联重复序列（ VNTR）位点（ SAL02、SAL11、SAL16、SAL20、TR4699）设计MLVA分型方案，运用MLVA分型方案和国际PulseNet公布的沙门菌PFGE分型方案对2002至2007年21株流行病学不相关的深圳社区感染伤寒沙门菌基因分型，比较这两种分型方法对伤寒沙门菌基因分型的能力。结果5个单一VNTR位点对深圳地区伤寒沙门菌的分型能力（ D值）为0.838～0.943；使用MLVA分型方法，获得19种MLVA型别；使用PFGE分型方法，获得19种PFGE型别；两种分型方法的D值均为0.99，且结果完全一致。结论5个VNTR位点的MLVA分型方法可作为一种简单快速准确的基因分型方法用于伤寒沙门菌感染流行的分析。
关键词： 伤寒沙门菌 基因分型 多位点串联重复序列分析 脉冲场凝胶电泳 -
伤寒沙门菌DNA旋转酶gyrA及拓扑异构酶Ⅳ parC基因与耐喹诺酮类关系研究
目的 研究DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ在伤寒沙门菌耐喹诺酮类药物的作用.方法 对临床分离喹诺酮类敏感伤寒沙门菌275及其自发耐药变异菌RG1的gyrA、parC基因喹诺酮类耐性决定区进行PCR DNA直接测序分析.结果 表明伤寒沙门菌275 gyrA、parC与大肠埃希菌相应DNA序列分别有92.51%与97.01%同源性,推定氨基酸序列仅有3与6个的差异.伤寒沙门菌gyrA及parC也有较好同源性,相应区段氨基酸有60.92 %相同.伤寒沙门菌RG1与275相比,gyrA第247位T→G变异,致Ser 83 Ala氨基酸替换,两者parC完全相同.喹诺酮类药物对RG1 MIC较对伤寒沙门菌275上升32倍或以上.结论 DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ为喹诺酮类药物作用靶位,但以DNA旋转酶为主,该酶变异为伤寒沙门菌耐药的主要原因.
