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离子型谷氨酸受体2B亚型在大鼠脊神经结扎后神经痛中作用的初步探讨
目的 脊髓创伤后引起的神经痛是困扰患者的重要因素,目前临床上尚无有效的治疗方案.通过大鼠L5脊神经结扎(SNL)法建立后肢神经痛模型,观察不同时间点脊髓背根神经节中离子型谷氨酸受体2B亚型(NR2B)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达变化并探讨可能存在的分子作用机制. 方法 36只成年SD雄性大鼠,随机数字表法分成对照组,假手术组和手术组.对照组不做任何处理,手术组建立脊神经结扎模型,假手术组操作同手术组仅不结扎脊神经.通过旷场试验及术侧足跖缩足阈值观察造模前,造模后第5,14天大鼠活动和神经痛情况,免疫蛋白印迹法检测大鼠术侧腰4-6段脊髓背根神经节NR2B及TNF-α和BDNF表达情况. 结果 造模后5 d,与对照组比较,假手术组大鼠总里程略降低[(18225.15±371.76)mm vs(14927.93±560.87)mm,P<0.05],活动时间相比差异无统计学意义(P>0.05);手术组大鼠总路程,活动时间较对照组均显著降低[(18225.15±371.76)mm vs(3224.92±89.64)mm,(727.93±16.29)s vs (203.48±19.94)s,P<0.01].与假手术组比较,手术组大鼠总里程,活动时间显著减少(P<0.01).造模后14 d,与对照组和假手术组比较,手术组大鼠总路程和活动时间明显减少(P<0.01).造模前,3组大鼠 PWT相比差异无统计学意义(P>0.05).造模后5 d和14 d,与对照组及假手术组比较,手术组大鼠术侧PWT均显著降低(P<0.01).假手术组大鼠疼痛阈值未受到明显影响,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).造模后5 d,假手术组和手术组BDNF、TNF-α和NR2B表达较对照组升高(P<0.05),手术组BDNF、TNF-α和NR2B表达较假手术组升高(P<0.05).造模后14 d,与对照组和假手术组比较,手术组BDNF、TNF-α和NR2B表达升高(P<0.01). 结论 NR2B和BDNF表达可能在参与调节了神经痛的发生、发展过程.
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低频电针对SNL大鼠早期神经痛DRG p-TRPV1、CGRP的抑制作用
[目的]探讨低频电针干预早期神经痛对背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid type 1,TR-PV1)磷酸化与痛敏相关神经肽降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)与P物质(substance P,SP)的押制作用.[方法]SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组与电针组,每组8只.模型组采用脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)的方法制作大鼠神经痛模型.电针组采用2 Hz电针治疗,选取患侧“足三里”、“昆仑”穴,连续3d.检测D1、D3大鼠术侧后足缩腿阈(Paw withdrawal threshold,PWT),D3 L5 DRG p-TR-PV1、CGRP、SP水平.[结果]SNL模型大鼠早期即出现自发性疼痛,PWT显著下降(P＜0.001),L5 DRG p-TRPV1水平升高(P＜0.001),CGRP水平升高(P＜0.05),SP水平下降(P＜0.05).SNL假手术组大鼠PWT没有显著变化.2 Hz电针能提高SNL模型大鼠的PWT(P＜0.001),降低L5 DRGp-TRPV1水平(P＜0.05)与CGRP水平(P＜0.01),对SP水平没有显著影响.[结论]早期神经痛与DRG p-TRPV1、CGRP水平升高有关.低频电针能下调DRG p-TRPV1与CGRP水平,改善早期神经痛.
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Toll样受体介导雷公藤甲素对外周神经损伤所致神经病理性痛的镇痛作用
目的 探讨Toll样受体介导雷公藤甲素(Tw)对外周神经损伤所致神经病理性痛的镇痛作用.方法 将18只SD大鼠随机分为3组:假手术-二甲基亚砜(DMSO)(对照组)和SNL-DMSO组、SNL-TW组,每组6只.对SNL-DMSO组、SNL-TW组大鼠行脊神经结扎手术,建立神经病理性痛动物模型,检测不同干预措施对各组神经病理性痛行为学的影响,并通过免疫荧光组织化学观察大鼠脊髓背角小胶质细胞标记物OX42表达情况.结果 激光共聚焦显微镜下观察显示,对照组脊髓背角小胶质细胞OX42表达较低.SNL-DMSO组脊髓背角小胶质细胞OX42表达升高,SNL-TW组脊髓背角小胶质细胞OX42表达明显低于SNL-DMSO组.与对照组比较,SNL-DM-SO组、SNL-TW组术后3d机械性痛阈均明显降低(P＜0.05);与SNL-DMSO组比较,SNL-TW组术后3d机械性痛阈明显升高(P＜0.05).结论 鞘内注射TW可通过抑制Toll样受体3介导的小胶质细胞活化,从而缓解脊神经结扎导致神经病理性痛的机械性痛觉过敏.
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独一味单体抑制脊髓背角内AKT-mTOR信号通路缓解大鼠神经病理性痛
目的:观察鞘内给予独一味单体8-O-乙酰山栀苷甲酯(8-O-acetyl-SM,8-OaS)对慢性神经病理性痛大鼠脊髓背角内丝苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶点(the mammalian target of rapamycin,mTOR)信号转导通路表达的影响.方法:采用大鼠腰5脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)构建神经病理性痛模型,使用Von-Frey 细丝连续观察造模后大鼠术侧后足的痛阈改变;应用Westernblot法定量分析大鼠腰膨大节段AKT和mTOR的磷酸化水平;采用免疫荧光组织化学染色观察pAKT和磷酸化mTOR(pmTOR)在脊髓背角内的细胞定位.结果:由行为学数据可见,SNL模型大鼠机械性痛阈明显降低(P<0.01).术后1~7 d鞘内连续给予8-OaS进行人为干预,与给药前对比差异有统计学意义(P<0.05);免疫荧光双重标记记实验结果显示,脊髓背角内pAKT与星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)存在大量共表达,pmTOR在星形胶质细胞和神经元上均观察到大量阳性染色.Western blot实验结果提示,8-OaS能显著下调脊髓背角内pAKT和pmTOR蛋白的表达水平.结论:鞘内给予8-OaS可有效缓解由SNL诱导的机械性痛阈,其机制可能是8-OaS通过下调脊髓背角内AKT-mTOR信号通路的表达水平,进而抑制了星形胶质细胞的活化,从而达到缓解神经病理性痛的效果.
关键词： 8-O-乙酰山栀苷甲酯 脊神经结扎 星形胶质细胞 Akt-mTOR信号通路 大鼠 -
体视学研究SNL模型大鼠脊髓背角胶质细胞数量的动态变化
目的:探讨L5脊神经结扎(SNL)术后7d和28 d大鼠脊髓背角内胶质细胞数量的改变与意义.方法:3月龄雄性SD大鼠随机分为SNL组和假手术组,分别于术后7d和28 d取腰5节段脊髓制作石蜡包埋连续切片50张,等距随机抽选2套切片(每套各5张)分别用IBa-1和GFAP的免疫组织化学染色显示小胶质细胞(microglia,MG)和星形胶质细胞(astrocyte,AS).采用体视学技术-光学体视框估计单位体积脊髓背角内MG或AS的数量(数密度),将其乘以脊髓背角的横断面积和单位长度(1 mm),即可得到1 mm长脊髓背角内MG和AS的数量.结果:与未手术侧相比,SNL组手术侧1 mm长腰5节段脊髓背角内MG的数量在术后7d和28 d分别显著增加了210％和120％;AS的数量在术后7d显著增加了62％,术后28 d无明显增加.结论:神经病理性疼痛可能与胶质细胞数量的动态改变相关.
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TNF-α抑制剂对神经病理性痛大鼠镇痛作用及其机制探讨
目的:探究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)抑制剂XPro(R) 1595对大鼠脊神经结扎诱导的痛行为及脊髓背角白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和TNF-α表达的影响.方法:运用L5脊神经结扎的方法建立神经病理性痛模型,通过鞘内注射给予TNF-α抑制剂(XPro(R) 1595)进行干预,采用Von Frey丝测定大鼠足底50％机械缩足反射阈值;运用Western Blot方法检测大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6和TNF-α的表达情况.结果:(1)行为学结果显示:与对照组相比,脊神经结扎后大鼠表现出明显的机械性痛敏(P＜0.01),且可被鞘内注射XPro(R) 1595有效改善(P＜0.01);(2) Western Blot结果显示:与对照组相比,脊神经结扎组大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著升高,且可被鞘内注射XPro(R) 1595明显抑制(P＜0.01).结论:鞘内注射XPro(R) 1595能够显著改善大鼠脊神经结扎诱导的神经病理性痛,其机制与抑制脊髓背角IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的表达有关.
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雷公藤内酯醇(T10)通过抑制脊髓背角内p38-MAPK的磷酸化发挥镇痛作用的机制研究
目的:观察鞘内给予雷公藤内酯(triptolide,T10)对于慢性炎性痛和神经病理性痛模型大鼠脊髓背角小胶质细胞内p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化水平的影响.方法:采用大鼠足底注射完全弗式佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)构建慢性炎性痛模型,L5脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)和坐骨神经分支选择性结扎(spared nerve injury,SNI)的方法制作慢性神经病理性痛模型.利用von Frey丝刺激法连续观察造模后大鼠的痛行为变化;应用免疫荧光染色方法观察大鼠腰膨大节段胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和电离钙绑定衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)的表达水平;应用Western Blot方法观察大鼠腰膨大节段p38 MAPK的磷酸化水平.结果:(1)行为学结果显示:CFA、SNL、SNI模型大鼠机械性痛阈均明显降低,且术后一周内与正常对照组相比均保持在较低水平(P＜0.01).从术后第1d起鞘内连续给予T10至第7d,分别观察到T10能够明显提高上述模型大鼠手术侧后足的机械性痛阈(P＜0.05);但T10在SNL模型和SNI模型大鼠中的效果要弱于CFA引起的慢性炎性痛(P＜0.05).(2)免疫荧光染色结果显示:CFA、SNL和SNI模型大鼠腰膨大脊髓背角内GFAP、Iba-1的表达明显高于正常对照组,而p-p38 MAPK阳性产物主要表达于小胶质细胞内.(3)Western Blot结果显示:造模后7d脊髓背角内p-p38 MAPK的表达明显上调,鞘内给予T10后可以显著下调脊髓背角内p38的磷酸化水平(P＜0.05).结论:鞘内给予T10有效缓解由于CFA、SNL和SNI诱导的慢性痛模型大鼠的机械性痛阈的机制可能是通过下调脊髓背角内p38 MAPK信号通路的磷酸化水平,进而达到抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化.其次,T10对不同类型的疼痛模型的作用效果存在差异,对由CFA引起的慢性炎性痛的作用效果要强于由SNL和SNI诱导的慢性神经病理性痛.
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鞘内给予氯胺酮通过抑制星形胶质细胞内STAT3的磷酸化改善大鼠神经病理性痛的研究
目的:观察神经病理性痛大鼠鞘内给予氯胺酮对于脊髓背角星形胶质细胞内信号转导和转录活化因子3(STAT3)磷酸化水平的影响.方法:采用L5脊神经结扎(SNL)方法制作慢性神经病理性痛模型,利用机械刺激法和热板法连续观察造模后大鼠的痛行为变化;应用免疫组织化学染色和Western Blot方法观察大鼠腰膨大节段胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和磷酸化STAT3(pSTAT3)的表达水平.结果:SNL模型大鼠机械性痛阈和热痛阈均明显降低,且术后一周内均保持在较低的水平(P＜0.01),从术后第3d起鞘内连续给予氯胺酮至第7d能够明显缓解大鼠患侧后爪的机械性痛敏和热痛敏.免疫荧光组织化学染色显示:pSTAT3在星形胶质细胞上有表达,且SNL后pSTAT3与GFAP在脊髓背角的表达均升高.Western Blot结果显示:与对照组相比,SNL后第7d脊髓背角的pSTAT3的表达明显上调(P＜0.05),从术后第3d鞘内连续给予氯胺酮至第7d能够明显下调STAT3的磷酸化水平.结论:鞘内给予氯胺酮能够明显下调脊髓背角星形胶质细胞内STAT3的磷酸化水平从而达到缓解疼痛的目的.
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CGRP样阳性终末在脊神经结扎模型大鼠脊髓背角浅层内的表达变化
目的:观察降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)样阳性终末在L5脊神经结扎模型大鼠脊髓背角浅层内的表达变化.方法:建立大鼠L5脊神经结扎模型(L5 spinal nerve ligation model,SNL),建模后分别在1、3、5、7d和14 d不同时间点通过yon Frey丝检测大鼠后爪的机械性痛敏,然后在大鼠分别存活7d和14 d时灌注取材,采用免疫组织化学染色结合平均光密度(optical density,OD)分析的方法以及免疫电镜标记技术检测脊髓背角浅层内CGRP样阳性物质的表达变化.结果:(1)行为学结果显示:模型组大鼠的机械性痛敏的阈值明显降低,与正常组比较有显著性差异(p＜0.05),提示建模成功；(2)免疫组织化学染色显示:正常大鼠脊髓背角浅层内存在大量密集分布的CGRP样阳性终末,主要分布于脊髓背角的Ⅰ层和Ⅱ层.SNL模型大鼠在结扎7d和14 d后脊髓背角浅层内CGRP样阳性产物的表达明显增多,其平均OD值分别为38.30 ±3.11和35.70±2.36,与正常对照组(25.10 ±2.30)比较,具有显著性差异(P＜0.05)；(3)电镜结果显示:CGRP样免疫活性物质只分布于轴突终末内,且主要与树突结构形成非对称性突触.结论:CGRP样免疫阳性物质在SNL模型大鼠脊髓背角浅层内的表达增加,提示CGRP样阳性终末在伤害性信息的传递中具有重要作用.
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神经病理性痛大鼠中央杏仁核内磷酸化ERK的过表达参与负性情绪的产生
目的:观察神经病理性痛条件下细胞外信号调节激酶(extracellular singal-regulated kinase,ERK)对疼痛引起的负性情绪反应的影响.方法:应用Western blot和行为药理学方法,观察腰5脊神经结扎(L5 spinal nerve ligation,SNL)大鼠中央杏仁核外侧囊状部(latero-capsular division of central nucleus of amygdala,CeC)内ERK及磷酸化-ERK(phosphorylated-ERK,p-ERK)的表达情况及ERK磷酸化抑制剂对疼痛引起的负性情绪反应的影响.结果:SNL模型大鼠CeC内p-ERK的表达水平明显升高,与对照组相比,有统计学差异(P＜0.05),而总ERK的表达水平则未见组间差异;用超声波检测仪可以检测到SNL大鼠超声发声明显增多,但腹膜腔注射ERK磷酸化的抑制剂U0126后其超声发声被显著抑制.结论:中央杏仁核外侧囊状部内ERK的激活参与了神经病理性痛引起的突触可塑性,在痛相关情绪的产生中发挥了重要作用.
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氯胺酮对大鼠脊神经结扎神经病理性痛的作用
目的 探索鞘内注射氯胺酮能否通过抑制小胶质细胞的活化而治疗神经病理性痛.方法 利用大鼠脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)神经病理性痛模型,并鞘内注射氯胺酮,应用von Frey行为测试观察对大鼠基础痛阈和SNL所诱导的神经病理性痛的影响；通过免疫组织化学法检测其对大鼠脊髓背角小胶质细胞活化的影响.结果 鞘内注射氯胺酮能够降低SNL诱导的机械性痛觉增敏,但对正常大鼠的机械性基础痛阈没有显著影响.同时鞘内注射氯胺酮能抑制SNL所诱导的大鼠脊髓背角小胶质细胞的活化,结合荧光强度半定量检测,观察到鞘内注射氯胺酮可以降低SNL诱导的小胶质细胞活化特异性标记物OX-42的表达.结论 氯胺酮治疗神经病理性痛的镇痛机理可能是通过抑制神经损伤后小胶质细胞的活化.
