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2014年浙江省金华市涉禽场所A型流感病毒监测分析
目的 了解金华市涉禽场所A型流感病毒分布情况,评估人感染禽流感风险,为人禽流感防控工作提供科学依据.方法 选取全市155个涉禽场所,采集6类环境标本1445份,采用聚合酶链反应方法检测A型流感病毒,使用x2检验对检测结果进行分析.结果 全市10个县(市、区)A型流感病毒场所阳性率为50.97％,标本阳性率为26.44％.4类涉禽场所中,禽交易市场标本阳性率为33.94％,均高于规模禽养殖场、禽散养村和野生候鸟栖息地(均P＜0.01).6类环境标本中,其他类型(肺、肠等禽内脏废弃物)、禽宰杀加工清洗污水、禽宰杀加工器具涂抹物的阳性率均高于禽粪便、禽饮水、养禽笼具表面涂抹物(均P＜0.01).全市10个县(市、区)环境标本均有A型流感病毒检出,冬春季A型流感阳性率高于夏秋季(x2 =46.490,P＜0.01).城乡禽交易市场A型流感阳性率差异无统计学意义(x2 =0.040,P＞0.01).结论 金华市城乡禽交易市场、禽宰杀环节和冬春季A型流感病毒检出率较高,存在人感染风险.冬春季加强禽交易市场监管,落实检疫准入、消毒、休市、关闭等措施,推广禽类“杀白上市”模式,是降低人禽流感发生风险的关键.
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A型流感病毒NP基因核酸疫苗的构建与体外表达鉴定
目的构建A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,研究核酸疫苗主动免疫保护效应.方法从A型流感病毒逆转录获得NP基因,与表达载体pSECTAG 2/Hygro A构建核酸疫苗,采用脂质体转染法转染VERO细胞,经ELISA鉴定,A型流感病毒NP基因核酸疫苗在VERO细胞中得到了表达.结果结果显示,在转染后36h得到大化表达,其A450达到0.382.在36到60h时间范围内,NP蛋白表达量基本没有变化(在48h和60h的A450分别为0.385和0.387).结论成功构建了A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,为进一步研究该疫苗体内实验奠定了基础.
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A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定
目的从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2151中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础.方法经过连续三轮固相"亲和-洗脱-富集"筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS-PAGE和Western-blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物.采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析.结果从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3.其A450分别达到0.469、0.582和0.507.A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4096倍,ELISA结果仍为阳性.结论利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体.
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荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒
目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法.方法 根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验.结果 A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性.结论 本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测.
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猪在A型流感病毒种间传播的意义
流感病毒属正粘病毒科,为负链RNA病毒.根据其核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,可分为A、B、C三种类型,其中A型是造成流行的主要病原.A型流感病毒是高传染性的呼吸系统的病原微生物,常见于人类﹑猪﹑马和其他一些哺乳动物以及多种家禽和野生鸟类.猪对于禽流感和人流感都是易感的,在禽、人、猪流感病毒的基因片段中的重组已经在猪体内发生了,并且一些新的重组猪流感病毒也传染到人类,当前的例子[1]显示猪能够从禽类传递新病毒到其他哺乳动物.从猪到人的重组病毒的建立和传播在世界的任何地方都能发生.因此,应重视猪对于A型流感病毒这种物种间的传播的影响.
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两种煎法所得麻杏石甘汤煎剂对A型流感病毒感染小鼠的治疗作用
目的:比较研究麻黄先煎和4味药同煎所得麻杏石甘汤煎剂对A型流感病毒感染小鼠的治疗效果.方法:采用鼻腔接种法建立A型流感病毒小鼠肺部感染模型,实验设正常对照组、模型对照组、麻黄先煎组、4味药同煎组、奥司他韦组,经灌胃连续给药7d.分别于感染后治疗的第4,7天检测小鼠体重,第7天,常规检测肺质量指数;光学显微镜技术观察肺病理变化,透射电子显微镜技术观察肺组织超微结构.结果:①体重:感染后治疗4,7d,与正常对照组比较,模型对照组体重显著下降(P＜0.05);治疗7d,与模型对照组比较,奥司他韦组、麻黄先煎组体重显著增加(P＜0.01或P＜0.05).②肺指数:与 正常对照组比较,模型对照组肺指数显著增加(P＜0.01);与模型对照组比较,各治疗组肺指数明显降低(P ＜0.01或P＜0.05),其中麻黄先煎组与模型对照组比较,较显著性差异(P＜0.01),高于4味药同煎组与模型对照组比较的差异性(P＜0.05).③肺部病理变化:与正常对照组比较,模型对照组肺正常组织结构消失,肺泡内有大量炎症细胞浸润.与模型对照组比较,各治疗组肺组织病理变化得到改善,其中奥司他韦组、麻黄先煎组肺部病变程度较4味药同煎组轻.④肺组织超微结构:与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织超微结构受到破坏,表现为核膜与质膜模糊不清,细胞器减少,线粒体嵴减少或消失,内质网出现空泡样病变,胞浆内有大量病毒颗粒,各治疗组肺组织细胞超微结构得到改善,其中奥司他韦组、麻黄先煎组小鼠肺组织超微结构较4味药同煎组完整.结论:麻黄先煎煎剂抗A型流感病毒作用优于4味药同煎煎剂.
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扶正抗病毒方对A型流感病毒感染小鼠肺部病理变化与超微结构的影响
目的:观察扶正抗病毒方对A型流感病毒感染小鼠肺部病理变化与超微结构的影响.方法:采用鼻腔接种法建立A型流感病毒小鼠肺部感染模型.实验分为正常组、模型组、利巴韦林组和扶正抗病毒方组,经灌胃给药或给0.9％氯化钠溶液7d后,处理动物,常规检测肺重量指数；光学显微镜技术观察肺病理变化,透射电子显微镜技术观察肺组织超微结构.结果:①与正常组比较,模型组肺指数明显升高(P＜0.01),扶正抗病毒方组肺指数降低,与模型组比较,差异显著(P＜0.05).②与正常组比较,模型组肺脏充血、水胀,呈现暗褐色外观,肺泡、细支气管等正常组织结构消失,肺泡内有大量炎症细胞浸润.扶正抗病毒方组肺组织病理变化显著改善.③与正常组比较,模型组小鼠肺组织超微结构受到破坏,核膜与质膜模糊不清,细胞器减少,线粒体嵴减少或消失,内质网出现空泡样病变,胞浆内有大量病毒颗粒.扶正抗病毒方组肺组织细胞结构较完整,细胞器丰富,线粒体和内质网的改变程度低于模型组.结论:扶正抗病毒方对A型流感病毒感染所致的肺部病理变化与超微结构有改善作用.
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麻杏石甘汤及汤剂中聚集物体外对A型流感病毒活性的影响
目的:探讨麻杏石甘汤以及汤剂中聚集物体外对A型流感病毒活性的影响.方法:运用狗肾上皮(MDCK)细胞培养、MTT比色法检测7 200r/min离心上清经0.45μm膜过滤前后麻杏石甘汤蒸馏水煎剂样品体外对A型流感病毒活性变化;运用动态光散射粒度分析仪、场发射扫描电子显微镜分析过滤前后麻杏石甘汤以及聚集物的粒径及形貌特征.结果:麻杏石甘汤0.45μm膜过滤前后,对流感病毒感染MDCK细胞治疗指数(TI)分别为:3.65,0.27,膜过滤明显降低了滤过液的抗病毒活性;动态光散射测定结果表明,膜过滤去除了大量粒径较大的聚集物,明显缩小了体系的粒径分布范围,过滤后,体系平均粒径下降约70.00n m;电镜观察表明,粒径＞500.00nm的聚集物多截留于膜上.结论:麻杏石甘汤体外抗A型流感病毒活性与其汤剂中聚集物具有相关性.
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不同煎煮方法的麻杏石甘汤及其含药血清对A型流感病毒神经氨酸酶活性的影响
目的 探讨不同煎煮方法的麻杏石甘汤及其含药血清对A型流感病毒神经氨酸酶(NA)活性的影响.方法 以2-(4-m ethylum bellifery1)-α-D-N-acetyl neuraminic acid(MUNANA)为底物,检测不同煎煮方法的麻杏石甘汤药液、相应含药血清以及抑制病毒增殖作用中含药血清对流感病毒NA活性的影响.结果 (1)药液对流感病毒NA活性的影响:麻黄先煎25 min组和麻黄先煎30 min组的病毒NA荧光值低于4药同煎组(P ＜0.05,P＜0.01);(2)含药血清对流感病毒NA活性的影响:麻黄先煎30 min组、麻黄先煎40 min组的NA荧光值低于4药同煎组(P ＜0.05,P＜0.01);(3)抑制病毒增殖作用中,含药血清对流感病毒NA活性的影响:麻黄先煎5～20 min组、麻黄先煎30 min组、麻黄先煎35 min组病毒NA荧光值低于4药同煎组(P ＜0.05,P＜0.01).药物浓度方面,与25％的浓度比较,6.25％及12.5％浓度的含药血清对应的病毒NA荧光值降低(P＜0.01).结论 麻杏石甘汤煎煮方法的不同可以导致其抗流感病毒效果的差异.
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A型流感病毒同义密码子的使用偏性对RNA二级结构的影响
以A型流感病毒为研究样本,分析了同义密码子使用偏性对RNA二级结构的影响,为进一步研究同义密码子存在的意义及A型流感病毒RNA特征提供一些理论依据.收集整理了NCBI中收录的全部A型流感病毒的核酸序列信息,计算了每一条核酸序列的RNA二级结构,计算出RNA环结构含量和茎结构含量及折叠自由能.在此基础上,计算了RNA二级结构的柔性.同时,计算了每一条核酸序列的相对同义密码子使用值.由此,建立了A型流感病毒RNA二级结构数据库.分析每条核酸序列的相对同义密码子使用值与RNA的环结构、茎结构及柔性之间的关系.分析结果表明,50％的氨基酸的相对同义密码子使用值与RNA茎结构含量和环结构含量显著相关;60％的氨基酸的相对同义密码子使用值与单位平均折叠自由能显著相关;50％的氨基酸的相对同义密码子使用值与RNA柔性显著相关.进一步分析发现,与茎结构含量和环结构含量都显著相关的密码子,它们的相对同义密码子使用值与两种结构含量的相关性截然相反,而且发现,在所选的参量中,RNA柔性与相对同义密码子使用值显示出更好的相关性.结果证实,对于A型流感病毒,同义密码子的使用偏性对RNA二级结构存在很大的影响.
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1995～2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关性研究
为了探讨中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行关系,对1995～2005年中国分离的550株H3N2流感病毒的HA1序列进行分析.HA1基因进化树显示出以很长的主干和很短的侧枝为特征.HA1的氨基酸位点变异主要位于5个已知的抗原位点及其附近,同时其它位点也有改变.通过对HA1序列资料分析发现这期间导致H3N2流行的序列改变的三种可能,第一种是同时出现多位点变化,第二种是位点变化逐渐发生累积到多个位点变化,第三种是单个抗原位点和受体结合位点同时改变,均可以引起H3N2流行.
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抗A型流感病毒广谱中和抗体及广谱通用疫苗研究进展
接种流感疫苗是预防和控制流感流行的有效手段,可诱导广谱、长期保护作用的通用流感疫苗研究尚处于初级阶段.现已鉴定报道了几个广谱中和抗体可以抵抗多种A型流感病毒,病毒表面抗原血凝素(haemagglutinin,HA)与抗体的复合物晶体结构揭示了至少3个高度保守表位.深入了解中和抗体与抗原互作分子机制可以为合理设计通用流感疫苗提供新策略,同时对开发新的抗流感病毒治疗抗体药物也具有重要启示意义.本文综述了A型流感病毒广谱中和抗体和广谱通用疫苗的研究进展.
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甲型H1N1流感的护理体会
目的 探讨甲型H1N1流感患者的护理经验.方法 回顾性分析1例重型甲型H1N1流感患者的临床特点,并阐述了护理经验.结果 治愈出院.结论 加强消毒隔音、个人防护、心理干预及健康教育等护理措施,成功救治患者,有效控制院内感染的发生,使患者短期内康复出院.
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NF-κB对病毒性心肌炎小鼠心肌中促炎细胞因子的调控
目的 探讨核因子-κB(NF-κB)对A型流感病毒(IAV)性心肌炎小鼠心肌中促炎细胞因子的调控作用.方法30只8周龄雄性BALB/c小鼠随机分3组:①正常对照组(C组):经鼻吸入15μl生理盐水;②感染对照组(I组):经鼻吸入40空斑形成单位(pfu)IAV;③PDTC组(P组):经鼻吸入40pfu IAV,腹腔注射NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)(10mg/kg),每天1次.感染后第9天处死小鼠,切取心脏组织进行病理及生化检查.结果IAV感染可诱导心肌中促炎细胞因子白介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)α显著上调(P<0.01,P<0.05),引发心肌急性炎性反应,部分心肌组织坏死.PDTC显著抑制促炎细胞因子在心肌中表达(P<0.01),有效抑制IAV病毒复制(P<0.01),减轻心肌炎性反应.结论IAV感染心肌组织后可能通过NF-κB信号通路诱导心肌中促炎细胞因子表达上调,抑制NF-κB激活可能为预防和治疗流感病毒性心肌炎提供新的思路.
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儿童A型流感病毒与呼吸道合胞病毒性肺炎血清细胞间黏附分子-1的表达及意义
目的：探讨儿童A型流感病毒肺炎与呼吸道合胞病毒性肺炎中血清可溶性细胞间黏附分子-1的表达及其意义，以指导临床治疗和预防。方法：选取于本科住院的肺炎儿童，根据逆转录聚合酶链反应结果分为FA组（A型流感病毒阳性）36例，RSV组（呼吸道合胞病毒阳性）22例，同时选取同期来本院体检的健康儿童41例为对照组，分析比较三组儿童的血清sICAM-1值。结果：FA组和RSV组血清sICAM-1值均高于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：A型流感病毒肺炎与呼吸道合胞病毒性肺炎儿童中sICAM-1表达水平升高，是导致儿童气道炎症的重要炎症因子之一，可为临床治疗采用抗粘附疗法及抗炎抑制炎性因子提供佐证。
关键词： 儿童 A型流感病毒 呼吸道合胞病毒 肺炎 血清可溶性细胞间黏附分子-1 -
基于TLR4-MyD88-TRAF6信号通路的麻杏石甘汤抗A型流感病毒感染小鼠所致的病毒性肺损伤研究
目的 探索Toll样受体4(TLR4)在A型流感病毒所致肺组织损伤中的影响,并进一步探讨麻杏石甘汤的干预作用.方法 以A型流感病毒滴鼻感染WT型小鼠为研究对象,实验设麻杏石甘汤低、中、高剂量(1.4、2.8、5.6 g/kg)组、奥司他韦(21.63 mg/kg)组、模型组和对照组,ig给予相应药物5d后,处理动物.常规法检测小鼠体质量,计算肺指数、脾指数、胸腺指数,观察肺组织病理变化,ELISA法检测肺泡灌洗液中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的量,real-time PCR (RT-PCR)法和Western blotting法检测肺组织中TLR4、MyD88、TRAF6mRNA和蛋白的表达.结果 麻杏石甘汤能上调A型流感病毒感染小鼠的体质量、脾指数、胸腺指数,改善肺组织病理损伤,降低肺泡灌洗液中促炎因子水平,下调肺指数和肺组织中MyD88、TRAF6 mRNA和蛋白表达量,且存在一定的量效关系.其中麻杏石甘汤中、高剂量组的疗效与奥司他韦接近.结论 麻杏石甘汤作为有效的抗流感病毒中药复方,能有效地减轻肺部炎症、保护免疫器官、调节细胞因子平衡,其可能的作用机制是通过抑制TLR4-MyD88-TRAF6信号通路的激活而缓解A型流感病毒感染小鼠所致的肺损伤.
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麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用
目的:通过观察麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠免疫器官重量指数和IL-2、TNF-β蛋白表达水平的影响,探讨该方对A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用.方法:采用鼻腔接种法建立A型流感病毒小鼠肺适应株动物感染模型.实验设麻杏石甘汤组、利巴韦林组、抗病毒颗粒组、模型对照组和正常对照组,经灌胃给药或给生理盐水后,检测小鼠体重、肺指数、脾指数、胸腺指数和肺组织中IL-2、TNF-β的蛋白表达水平.结果:麻杏石甘汤明显提高A型流感病毒感染小鼠的体重、脾重指数、胸腺指数与肺组织中IL-2的蛋白表达水平,降低肺指数和肺组织中TNF-β的蛋白表达水平.结论:麻杏石甘汤通过提高小鼠免疫器官重量指数、调节细胞因子的蛋白表达水平而对流感病毒感染小鼠起保护作用.
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广谱流感疫苗的研究进展
流行性感冒(简称流感)的频频暴发严重危害人类健康和公共卫生 ,已引起全球范围内的高度关注.预防流感有效和经济的措施是接种疫苗 ,但流感病毒的持续变异可逃逸人群已有的免疫应答 ,目前使用的季节性流感疫苗仅对亚型内抗原匹配较好的毒株产生免疫保护作用 ,难以有效应对因抗原漂移或抗原转换而产生的无法预料的流感大流行.因此 ,研发对流感病毒不同亚型均具有交叉免疫保护作用的广谱流感疫苗具有重要意义.近年来 ,流感病毒广谱中和抗体的发现、对流感病毒抗原保守区域及细胞免疫机制的深入研究、疫苗免疫策略的优化等都为广谱流感疫苗的研发提供了新思路.本文简述了近几年基于血凝素、基质蛋白、核蛋白等多种流感靶抗原的广谱流感疫苗的研究进展.
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A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展
A型流感病毒引起的疾病主要包括猪流感、禽流感、人类流感等,主要通过飞沫传播,可引起全身肌肉酸痛、疲倦无力、厌食,并可能引发病毒性肺炎[1].高致病性禽流感感染还可能引发严重的并发症,包括广泛的肺水肿、急性呼吸窘迫综合症、以肾和心脏功能失调为代表的多器官功能衰竭[2],病死率极高.
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高致病性禽流感与学校卫生
历史上禽流感曾给许多国家和地区造成巨大经济损失,也曾间接(通过"基因混合器"--猪)危害到人类健康.但是,从1997年开始,禽流感直接侵袭人类的事件频频发生.1997年香港禽流感、2003～2004年越南、泰国等地的禽流感,都是从禽直接感染人并致多人死亡.禽流感爆发间隔越来越短、范围越来越大、危害越来越重,似乎预示着人类禽流感大爆发的可能.
