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颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究
托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)是临床上广泛使用的抗胆碱药物,颠茄是药典收录的TAs主要的商业栽培药源植物.基于颠茄转录组测序数据构建TAs合成途径中9个结构基因(ODC,ADC,AIH,CPA,SPDS,PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ)UniGene序列的数字表达谱,采用qPCR对其中4个已报道基因(PMT,CYP80 F1,H6H,TRⅡ)的表达水平进行验证分析,同时采用HPLC测定不同组织中TAs含量.数字表达谱分析结果表明4个TAs上游合成途径基因(ODC,ADC,AIH,CPA)和2个支路途径基因(SPDS,TRⅡ)在颠茄各器官中均有表达,但在须根中高水平表达;3个TAs合成途径特异的结构基因PMT,CYP80 F1和H6H均只在须根中大量表达,主根中其次.qPCR检测PMT,CYP80 F1,H6H,TRⅡ的表达结果与数字表达谱基本一致,但PMT,CYP80F1,H6H在主根中表达量很低.莨菪碱质量分数在嫩茎中高(3.364 mg·g-1),幼叶,根,幼果和果萼中其次(分别为1.526,1.598,1.271,1.413 mg·g-1);东莨菪碱质量分数在果萼中高(1.003 mg· g-1),嫩茎和幼叶(分别为0.600,0.601 mg·g-1)中其次;2种生物碱在老茎(莨菪碱0.283 mg·g-1,东莨菪碱0.043 mg·g-1)和老叶(莨菪碱0.313 mg · g-1,东莨菪碱0.080 mg·g-1)中质量分数均为低.该研究结果表明须根是颠茄TAs生物合成主要器官,而地上幼嫩组织是TAs主要存贮积累器官,TAs合成后存在转运过程.PMT下游基因均只在须根中表达,筛选颠茄须根的转录组数据库就可能为解决该途径中不清晰的合成步骤和相关转录调控因子提供有力的帮助.
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过表达莨菪h6h基因提高颠茄东莨菪碱含量的研究
文章采用代谢工程方法培育东莨菪碱高产转基因颠茄.根癌农杆菌遗传转化颠茄,过量表达东莨菪碱合成途径中限速酶基因h6h(Hnh6h),卡那霉素筛选获得转基因植株,快繁炼苗后,田间栽培至果期.基因组PCR鉴定转Hnh6h基因颠茄.SPSS软件分析转基因与非转基因颠茄株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等性状的差异；HPLC测定其根、茎、叶、果中莨菪碱及东莨菪碱含量；采用qPCR技术测定各组织Hnh6h基因表达量.结果所获得的5个转基因颠茄株系(A8,All,A12,C8,C19)都能同时检测到Kanr和Hnh6h基因,在非转基因颠茄中没有检测到这2个基因；与非转基因颠茄比较,转基因颠茄株系的株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等都没有降低,且部分性状优于对照.转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量高,且高于莨菪碱；不同转基因颠茄株系叶片中东莨菪碱含量依次为C8 ＞A12 ＞C19 ＞All ＞A8,C8的东莨菪碱质量分数(2.17 mg·g-l DW)比非转基因颠茄(0.42 mg·g-1 DW)提高4.2倍；在转基因颠茄根、茎、叶和果中都检测到Hnh6h基因表达,且在叶片中表达量高,非转基因颠茄没有检测到Hnh6h基因表达.因此,过表达Hnh6h基因能够打破颠茄的东莨菪碱生物合成的限速反应,从而推动代谢流向东莨菪碱合成方向流动,提高了东莨菪碱合成能力,终获得了东莨菪碱高含量的转基因颠茄.
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酵母提取物对颠茄毛状根氮代谢及次生代谢影响的机制探究
以颠茄毛状根为试验材料,向培养基中添加酵母提取物(yeast extract,YE),测定颠茄毛状根氮代谢关键酶的活性,各形态氮的含量,次生代谢前体物质含量,次生代谢途径中关键酶基因相对表达量以及主要托品烷类生物碱(tropane alka-loids,TAs)莨菪碱和东莨菪碱的产量,初步探究YE诱导合成颠茄毛状根次生代谢产物的机制.结果表明:较对照组而言,氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著升高,谷氨酸脱氢酶(GDH) 活性变化不显著.硝态氮,铵态氮含量显著下降,而可溶性蛋白,游离氨基酸,总氮含量均显著升高.此外,YE处理颠茄毛状根提高了次生代谢途径中的前体氨基酸(鸟氨酸和精氨酸) 的含量以及代谢前体腐胺的含量,3个关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶基因(putrescine N-methyl transferase,pmt) 、托品酮还原酶-Ⅰ基因(tropinone reductase-Ⅰ,trI)和莨菪碱6-β-羟化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydrox-ylase,h6h)的相对表达量也呈现不同幅度的上升,终导致莨菪碱和东莨菪碱产量的增多,在处理16 d后分别是对照组的3. 09,1. 85倍.这说明YE诱导氮代谢关键酶活性升高使氮代谢加速,为次生代谢中含氮化合物的合成提供更多原料,同时通过调控次生代谢途径中关键酶基因的表达,使莨菪碱和东莨菪碱产量提高.
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茉莉酸甲酯对颠茄托品烷类生物碱代谢及相关基因表达的影响
莨菪碱和东莨菪碱是颠茄中重要的托品烷类生物碱次生代谢产物,具有多方面药理价值.该研究采用土培法种植颠茄实生苗,设置不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)处理,分析不同浓度MeJA对颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量、生物碱合成的上游物质以及关键酶基因表达量的影响.结果表明,MeJA浓度为200 μmol·L-时更有利于颠茄生物碱的积累;对腐胺(Put)及其合成的关键酶活性的测定发现,Put的含量与其合成的关键酶活性的变化基本一致,都随MeJA浓度升高先增加后降低,Put含量在MeJA浓度为200 μmol·L-1时达到高;对PMT,TRⅠ,H6H表达量的检测发现,200 μmol· L-MeJA处理下叶片和根部TRⅠ,H6H基因均有较高的表达水平,PMT基因表达量无明显变化趋势.以上结果说明,MeJA对颠茄莨菪碱和东莨菪碱合成的调控主要依靠影响关键酶基因的表达量发挥效用,适宜浓度茉莉酸甲酯提高了颠茄叶片TR Ⅰ和根部TR Ⅰ与H6H表达量,从而促进莨菪碱的合成和莨菪碱向东莨菪碱的转化,提高颠茄体内莨菪碱和东莨菪碱的积累.
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氮素形态对颠茄生物碱积累及相关基因表达的影响
莨菪碱和东莨菪碱是颠茄含有的2种主要生物碱,具有重要的药用价值.该研究以颠茄实生苗为材料,设置不同铵硝配比处理,分析不同形态氮素对颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量和生物碱合成的上游产物、信号分子以及关键酶基因表达量的影响.结果显示,铵硝比50∶50更有利于颠茄生物碱的积累和莨菪碱向东莨菪碱的转化.对Put及其合成关键酶的检测发现,腐胺的含量与腐胺合成的关键酶活性变化基本一致,它们都随铵态氮比例的增加而升高,在铵硝比75∶25达到高;对信号分子NO的检测发现,NO浓度随处理液中硝态氮比例的减小而减小;对PMT,TRⅠ,H6H表达量的检测发现,少量铵态氮增加了根部PMT,H6H基因表达量,铵硝比为50∶50时叶片和根部PMT,TRⅠ,H6H基因都有较高的表达水平.以上结果表明,氮素形态对颠茄莨菪碱和东莨菪碱合成的调控主要通过影响关键酶基因的表达量起作用,铵硝等比供氮条件提高了颠茄叶片中TRⅠ和根部PMT与H6H表达量,因此促进了腐胺向莨菪碱的合成以及莨菪碱向东莨菪碱的转化,使颠茄能够积累更多的莨菪碱和东莨菪碱.
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颠茄致急性尿潴留1例
1 病例报告患者男,86岁.因上腹痛伴恶心1h余就诊.既往有高血压病、冠心病、前列腺增生症病史.查体:体温36.6℃,呼吸16次/min,脉搏60/min,血压135/80 mmHg,心电图大致正常;神志清楚,心肺正常;上腹部轻度压痛,无反跳痛,肝脾肋下未触及,莫氏征阴性,未触及腹部包块,肠鸣音10次/min.考虑为急性胃炎.给予枸橼酸铋钾胶囊0.3g,餐前30 min口服,3次/d;颠茄片20mg口服.服药后上述症状缓解,但出现口干和下腹胀满,不能自主排尿.结合患者有前列腺增生症病史,考虑颠茄引起的急性尿潴留,立即后送上级医院.给予导尿并留置导尿,坦索罗辛片0.2mg,1次/d;非那雄胺片5ng,1次/d.5天后拔除导尿管,排尿通畅,无明显不适出院.
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转NtPMT和HnH6H转变莨菪碱型颠茄为东莨菪碱型颠茄
颠茄(Atropa belladonna)是生产药用托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)的商业药用植物.颠茄中莨菪碱含量远高于东莨菪碱,其化学型属于莨菪碱型,提高其东莨菪碱含量,使其化学型转变为东莨菪碱型是该产业追求的共同目标.本课题组在已经获得的T0代转NtPMT和HnH6H颠茄基础上,采用自交法培育出T1代转基因颠茄并在西藏林芝进行了田间试验.在T1代转基因颠茄中能同时特异性地扩增出461 bp的NtPMT和1 077 bp的HnH6H片段,在野生型颠茄中则不能,表明获得了阳性的T1代转基因颠茄.RT-PCR表明NtPMT和HnH6H在转基因颠茄叶片有表达.HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱结果表明:T1代转基因颠茄叶片和茎杆几乎没有莨菪碱,东莨菪碱是主要的生物碱;野生型颠茄叶片和茎杆绝大多数为莨菪碱(东莨菪碱含量极低).T1代转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量比野生型颠茄叶片提高了15～36倍;T1代转基因颠茄茎杆中东莨菪碱含量比野生型颠茄茎杆提高了37～108倍.NtPMT和HnH6H双基因过表达使得莨菪碱转化为价值更高的东莨菪碱,大大提高了颠茄药用和商业价值.
关键词： 颠茄 东莨菪碱 腐胺-N-甲基转运酶 莨菪碱-6β-羟化酶 代谢工程 -
过表达内源PMT和H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响
颠茄是我国药典规定的托品烷类生物碱包括东莨菪碱和莨菪碱主要的商业栽培的药源植物.本研究采用基于发根的基因表达系统,农杆菌介导遗传转化颠茄,潮霉素筛选获得转颠茄自身PMT和H6H基因发根;基因组PCR鉴定转基因发根;液体摇床培养后,HPLC测量莨菪碱和东莨菪碱含量;qPCR检测颠茄PMT和H6H基因表达水平.基因组PCR检测获得5个双基因共转化颠茄发根系,其中2个发根系(PH2和PH14)的总生物碱含量得到显著提高,高的PH2总生物碱含量为非转基因发根的2.7倍；另外3个转基因发根系总生物碱含量与对照相比没有显著性差异.4个转基因发根系(PH2、PH32、PH14和PH20)东莨菪含量都有提高,其中PH2东莨菪碱含量比对照提高了8.2倍.基因表达量与生物碱含量结果基本一致,说明颠茄发根中PMT和H6H两者同时维持高水平表达可以极大程度的促进东莨菪碱积累.
关键词： 东莨菪碱 颠茄 N-甲基-腐胺-转移酶 莨菪碱6β-羟化酶 -
复方草豆蔻酊颠茄酊口服溶液的制备与临床应用
目的 建立复方草豆蔻酊颠茄酊口服溶液的制备与质量控制方法 .方法 采用浸渍法制备复方草豆蔻酊,姜酊,加市售颠茄酊、橙皮酊、甘油、蒸馏水制备复方草豆蔻酊颠茄酊口服溶液.以薄层色谱法鉴别方中主要药物草豆蔻、颠茄.结果 薄层色谱法可准确鉴别出草豆蔻、颠茄的特征斑点.结论 薄层色谱法制备工艺可行,质量稳定;薄层斑点清晰,重现性好,操作简便,可用于复方草豆蔻酊颠茄酊口服溶液的质量控制.
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胃康灵胶囊的薄层色谱研究
胃康灵胶囊由三七、延胡索、颠茄等药配伍组成的,具有柔肝和胃,散瘀止血,缓急止痛,祛腐生新作用,用于急、慢性胃炎,胃溃疡,糜烂性胃炎,十二指肠溃疡及胃出血等症.方中三七为五加科多年生草本植物三七Panax noto-ginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根[1].主要成分为人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd,三七皂苷D1、C、D2、E2及三七黄酮等.
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复方颠茄对氯氮平所致流涎反应的治疗作用
氯氮平是目前精神科治疗有效的药物之一,被广泛应用于临床.它多见的副反应是流涎,发生率高达60%以上,给服用者的日常生活带来诸多不便,以致拒药[1,2].从1993年8月～1995年2月,本院试用复方颠茄片(简称颠茄,每片含颠茄浸膏10 mg、苯巴比妥15 mg)治疗流涎反应,疗效明显,现报告如下.
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RP-HPLC法测定颠茄磺苄啶片中磺胺甲基异呈噁唑与甲氧苄啶含量
目的采用反相高效液相色谱法测定颠茄磺苄啶片中磺胺甲基异(口恶)唑与甲氧苄啶的含量.方法 RP-HPLC法.SerialC18色谱柱;甲醇-0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(25:75)为流动相;检测波长为240 nm;外标法测定.结果磺胺甲基异(口恶)唑平均回收率为98.8%,RSD为0.75%;甲氧苄啶平均回收率为98.7%,RSD为1.01%.结论该方法简便、准确、可靠,可用于颠茄磺苄啶片中磺胺甲基异(口恶)唑及甲氧苄啶的含量测定.
关键词： 颠茄 磺胺甲基异(口恶)唑 甲氧苄啶 颠茄磺苄啶片 含量测定 -
磷酸可待因、颠茄片联合治疗婴幼儿难治性腹泻的疗效
目的 探讨磷酸可待因、颠茄片联合治疗婴幼儿难治性腹泻的效果.方法 年龄2个月～1岁、平均腹泻次数＞7次/d患儿96例,随机分为2组.对照组40例予以微生态疗法及肠黏膜保护剂,治疗组56例加用小剂量磷酸可待因和颠茄片,观察治疗前后患儿临床表现.结果 1个疗程对照组有效率为63%,治疗组有效率为96%,二组比较有显著差异(χ2=27.928 P＜0.005).治疗组腹痛、腹胀和黏液稀便等症状较对照组明显好转,24 h平均大便次数恢复正常,病程显著缩短.未观察到磷酸可待因呼吸抑制及成瘾性等不良反应.结论 小剂量、短期使用磷酸可待因、颠茄辅配合常规微生态疗法及肠黏膜保护剂,能显著缩短婴幼儿难治性腹泻的治疗时间.
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颠茄联用安定治疗小儿尿频症的药理分析及病例对照
联用颠茄及安定治疗小儿尿频与传统的治疗方法阿托品合用安定进行了对照研究,结果表明,颠茄合用安定病例组治愈率为60%(P<0.05),统计学处理有显著性差异,提示新方案的疗效优于传统方法,值得推广.
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7个颠茄品系的光合特性比较研究
目的:探讨颠茄不同品系叶片的光合特性及其影响因子,为颠茄的高产栽培提供理论依据.方法:选择1个非转基因品系(Ctr)和6个转基因品系(Tr1 ～6)的植株为研究对象,在初花期利用LI-6400XT光合仪测定植株叶片的光合-光响应曲线及光合日进程.结果:不同颠茄品系叶片的光响应曲线与非直角双曲线方程拟合度较高(R2＞0.98).Tr3品系的大光合速率和光能利用效率均大于其他品系.不同颠茄品系叶片的净光合速率日变化曲线呈单峰曲线,不存在“午休”现象,蒸腾速率也呈单峰曲线,这是颠茄减少高温伤害的一种自我保护机制.通过相关性系数分析表明,颠茄光合速率与蒸腾速率和光合有效辐射呈显著或极显著正相关.结论:颠茄通过引种产生了光照适应性,人工种植时应选择光照充足的地块,合理密植以提高产量.
