首页 > 文献资料
-
穿心莲中1个新NADPH-细胞色素P450还原酶的克隆及功能鉴定
穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析.细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用.该研究通过同源比对筛选并克隆了 穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4.原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物.为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇.实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加.该表达模式与穿心莲内酯受MeJA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关.
关键词： 穿心莲内酯 生物合成途径 细胞色素P450还原酶 原核表达 功能鉴定 -
家蝇细胞色素P450还原酶的原核表达与活性鉴定
目的 家蝇是重要的卫生害虫,其抗药性问题突出,其中细胞色素P450介导的代谢解毒作用增强是其抗药性的重要机制.细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是细胞色素P450酶系的重要组分,建立家蝇细胞色素P450还原酶(MdCPR)表达体系有助于通过重组家蝇细胞色素P450酶系以鉴定家蝇抗药性的生物化学机制.方法 将家蝇CPR基因的编码区克隆到表达载体(pB508)上构建重组质粒,在大肠埃希菌中重组质粒经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达的MdCPR蛋白进行细胞定位分析和活性测定.结果 MdCPR蛋白在大肠埃希菌中成功地得到表达,分子质量为76×103左右,表现出细胞色素C还原酶活性,主要定位在细胞的膜成分中.结论 在大肠埃希菌中表达了具有还原酶活性的MdCPR蛋白,为进一步研究家蝇细胞色素P450的功能及其在抗药性中的作用奠定了基础.
关键词： 家蝇 细胞色素P450还原酶 功能表达 活性检测 -
茯苓细胞色素P450还原酶基因的克隆与生物信息学分析
目的 从茯苓Poria cocos中克隆出细胞色素P450还原酶(CPR)基因,并对其进行生物信息学分析.方法 利用茯苓转录组注释信息,通过RACE扩增得到茯苓CPR基因(PcCPR)全长,并PCR得到对应基因组DNA序列.通过生物信息学方法,对该基因编码蛋白的特征进行分析,I-TASSER模拟出蛋白三级结构,MEGA构建蛋白系统进化树.结果 获得含有完整开放阅读框(ORF)的cDNA全长2 514bp(GenBank号为KP768251),PcCPR的基因组DNA 5 292bp(GenBank号为KP896487),含4个外显子、3个内含子.基因编码732个氨基酸的蛋白,相对分子质量81 147,等电点(pI)为5.39,为不稳定性亲水蛋白,非分泌蛋白,且不具有信号识别功能.蛋白定位于内质网上,第7～22位氨基酸为跨膜区;具有2个黄素结合的保守结构域,FAD、NADP的结合位点各自在蛋白三级结构空间上相邻近.同源性分析显示,PcCPR与担子菌CPR的相似性明显高于子囊菌CPR.结论 成功从茯苓中克隆得到PcCPR基因,为进一步研究PcCPR及相关代谢提供基础.
关键词： 茯苓 细胞色素P450还原酶 基因克隆 生物信息学分析 RACE -
全反式维甲酸在成年小鼠神经干细胞分化中的调控作用及机制
目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对成年小鼠神经干细胞(NSCs)的调控、信号通路及对细胞色素P450(CYP450)家族的影响.方法 分离并培养成年小鼠脑室下区NSCs,将细胞分为ATRA组和对照组,ATRA组加入10-6 mol/L ATRA,对照组正常培养.采用流式细胞仪检测两组细胞表面标记物,计算神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和NSCs占总细胞数的百分比;Real-time PCR方法检测CYP450家族相关基因表达情况,筛选出有统计学意义的基因;ELISA法测定细胞色素P450还原酶(CPR)的活性;Western blotting法检测P38 MAPK通路相关蛋白P38、p-P38蛋白的相对表达量.结果 ATRA组NSCs主要是向神经元分化,也有一部分向星形胶质细胞分化,少突胶质细胞较少.与对照组比较,ATRA组P450家族基因中CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1表达上调(P均<0.05).ATRA组CPR活性以及p-P38蛋白表达量均较对照组升高(P均<0.05).结论 ATRA促进小鼠NSCs向神经元分化,可能通过上调CYP450中的CYP26家族基因、增加CPR活性以及P38 MAPK通路发挥调控作用.
