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滚环复制技术的建立及在RNA病毒基因检测中的初步应用
滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增.本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测.检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增.本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测103拷贝模式DNA分子的水平.与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究.
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RCA技术的应用及研究进展
滚环复制是噬菌体感染细菌后进行自我复制普遍采取的一种形式.这种复制形式可在同温下对环状单链DNA进行相对无限单链扩增.近年来在一些基因检测技术的研究中被广泛采用,并将与之有关的技术统称为滚环放大(rollingcircle amplification,RCA)技术[1].因为滚环复制的模板必须是封闭的单链环状DNA,许多研究者将这种特性用于单核苷酸多态性(SNP)及病毒基因检测和基因表达图谱等的研究中,还有一些实验直接将滚环的无限复制作为一种单纯的信号级联放大系统,并由此衍生出许多相关技术.本文综述了当前RCA技术及其相关的研究进展,并展望了该技术的应用前景.
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一种高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA全长基因组方法的研究
目的：建立基于滚环复制的、高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA（HBV RC-DNA）全长基因组的方法。方法以60例慢性乙型肝炎患者血清HBV RC-DNA为研究对象，利用T4 DNA polymerase和T4 DNA ligase，封闭HBV RC-DNA基因组上的缺口，使之成为闭合环状结构；再通过Phi29 DNA polymerase的作用，对闭合环状的HBV基因组进行滚环复制，以滚环复制后的RC-DNA为模板扩增HBV全长基因组。结果成功建立了基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法，可从病毒载量为108~104拷贝/ml样本中扩增出HBV全长基因组。对于107~105拷贝/ml血清样本来说，使用基于RC-DNA滚环复制的全长基因组扩增方法，与以往的一步法扩增相比，扩增效率显著提高。结论基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法具有较高的灵敏度。该方法的建立为H BV全基因组研究提供了一种新的、有效的工具，有望在基础和临床研究中广泛应用。
关键词： 松弛环状乙型肝炎病毒DNA 全长基因组 扩增 滚环复制 -
TT病毒分子生物学研究进展
TT病毒属圆环病毒科，其基因组为单链负股环状DNA，全长约3.8kb，由编码区和非编码区组成，前者至少含有6个公认的开放阅读框架。TT病毒以滚环复制方式主要在肝细胞和造血细胞中复制，其转录产物包括3.0、1.2、1.0kb等3种剪接mRNA。TT病毒的衣壳蛋白由3.0kbmRNA转译，而1.2kb、1.0kb mRNA表达产物为非结构蛋白，对转录过程起调节作用。近，有研究发现，TT病毒开放阅读框架表达一种可能对肾上皮细胞有损伤作用的类鱼精蛋白。
