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三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆
利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒 XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR.通过此融合片段两端引入的Xba I和Xho I酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cDNA克隆,命名为pBR-XJ160YE1.该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变.间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达.提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆.此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具.
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乙脑/登革2型嵌合病毒的构建
在乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体pPartial△prM/E中克隆入DV2(Dengue virus serotype z)的prM/E基因,构建乙脑/登革2型嵌合体克隆.将嵌合体克隆线性化后体外转录,获得的RNA转染BHK-21细胞,5～7d可观察到CPE.收获病毒上清液分别感染BHK-21细胞及C6/36细胞.接种于C6/36细胞中的嵌合病毒可使细胞出现CPE,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot检测显示:获得的嵌合病毒具有预期嵌合性核酸并能表达DV2的包膜蛋白,但不能在BHK-21细胞中传代培养.成功构建的乙脑/登革2型感染性克隆为进一步研究登革病毒疫苗奠定了基础.
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马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建
马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症[1].EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].在反转录病毒前病毒基因组两端含有长末端重复序列(long terminal repeat,LTR).LTR含有真核启动子,其中含有病毒转录调控顺式作用位点,病毒编码的反式作用因子与其结合后可以反式激活基因的表达,对病毒基因的表达和其它生命活动起重要调控作用[3,4].因此,LTR序列的变异可能会引起病毒转录和复制方式的改变,进而引起其细胞嗜性和致病性的改变[5,6].为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,用EIAV强毒L株LTR置换了以前构建的EIAV DLA(弱毒)感染性分子克隆中的LTR,构建了马传贫强/弱毒嵌合分子克隆,并获得了具有感染性的强/弱毒嵌合病毒.
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表达绿色荧光蛋白嵌合狂犬病病毒HEP-GFP株的拯救
狂犬病毒(Rabies Virus,RV)是人和犬、猫等多种动物狂犬病的病原,其基因组是单股负链RNA,基因组结构为3'-核蛋白(N)基因-磷蛋白(P)基因-基质蛋白(M)基因-糖蛋白(G)基因-大蛋白(L)基因-5'.
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以乙脑减毒活疫苗SA14?14?2为骨架的重组嵌合登革4病毒的构建与鉴定
登革4型病毒近年来在我国东南沿海地区时有流行,威胁人民健康与公共卫生安全.本研究以乙脑减毒活疫苗SA14?14?2为骨架,通过反向遗传学技术构建了携带登革4型病毒主要结构蛋白prM/E基因重组嵌合病毒(ChinDENV4);进一步通过蚀斑、 生长曲线、 动物实验等对其生物学特征进行了鉴定.结果显示,重组嵌合病毒ChinDENV4可高效表达登革4型病毒的结构蛋白,蚀斑大小与亲本株类似;ChinDENV4并能够在BHK?21、C6/36等细胞中高效复制,滴度分别达到1.26×105和1.58×106 PFU/mL.更重要的是,嵌合病毒ChinDENV4在乳鼠模型中的神经毒力显著弱于亲本株.本研究成功构建了乙脑/登革4型嵌合病毒,为下一步四价嵌合登革减毒活疫苗研究奠定了重要基础.
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新型登革热疫苗研制现状
蚊传登革(DEN)病毒和乙型脑炎病毒是人类中节肢动物传播的病毒性疾病的主要原因。目前尚无批准使用的能提供长期有效抗四个血清型DEN病毒的四价疫苗。本文概述了DEN疫苗研究的新进展，包括减毒活疫苗、传染性cDNA克隆、DEN病毒传染性克隆嵌合体、重组亚单位疫苗和裸DNA疫苗的开发策略。
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马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建
在已有全长感染性克隆pLGFD3-8和pD70344的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换.将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT-PCR方法及Real-time RT-PCR验证其感染性.结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的EIAV颗粒.pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8具有相似的复制水平,pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞.此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础.
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基于HIV-1 pNL4-3构建含CRF07_BC V3的嵌合分子克隆
目的 在感染性克隆pNL4-3骨架上构建含CRF07_BC V3的嵌合分子克隆.方法 通过融合PCR将CRF07_BC pXJDC13的V3环与pNL4-3的env骨架进行融合并克隆至pNL4-3上.经过鉴定后将阳性V3嵌合克隆pNL4-3/XJDC 13V3转染到293T细胞进行病毒包装并检测病毒的感染性.V3嵌合病毒的细胞嗜性分别用Ghost细胞系和MT-2细胞进行测定.结果 利用融合PCR克隆方法在pNL4-3骨架上成功构建了含CRF07_BC pXJDC13 V3的嵌合分子克隆pNL4-3/XJDC 13V3.该嵌合病毒利用的辅助受体为CCR5,不能利用CXCR4,也不能在MT-2细胞上诱发合胞体.结论 在pNL4-3骨架上成功构建了含CRF07_BC pXJDC13 V3嵌合分子克隆pNL4-3/XJDC13V3.该嵌合分子克隆为进一步研究CRF07_BC嗜性转变中V3关键位点提供了有利工具.
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登革2型型内嵌合病毒全长cDNA克隆的构建
运用OL-PCR(Overlap PCR)方法,扩增出D2-04和D2-MON501结构蛋白区、5′非编码区等区域的嵌合片段,以此片段替换pDVWS501质粒中的相应部分后,转化DH5α菌.测序结果表明,已成功构建含有D2-04株完整的PrM和E基因、一部分C基因,及D2-MON501株非编码区、非结构蛋白区和大部分C基因的嵌合病毒全长cDNA(QH-04/MON501)克隆.为进一步研究登革2型病毒结构蛋白区对毒力的影响打下基础.
