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链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化
目的 构建链霉亲和素(streptavidin,SA)和自噬相关基因(Beclin 1)重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白(含His标签)在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.
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白芨胶载外源性碱性成纤维细胞生长因子促进伤口愈合的实验研究
背景:研究发现白芨凝胶可显著促进大鼠背部全层皮肤缺损创面肉芽组织、毛细血管的生长及创面组织血管内皮生长因子的表达,碱性成纤维细胞生长因子可显著促进兔背部全层皮肤缺损创面胶原纤维增生、毛细血管增多和扩张,但其在常温下易分解,影响功效发挥.目的:观察白芨联合外源性碱性成纤维细胞生长因子促进创面愈合的效果.方法:在40只新西兰大白兔背部制作全层皮肤缺损创面,随机分4组干预,白芨组创面外敷白芨,细胞因子组创面外喷碱性成纤维细胞生长因子液,联合组创面外敷白芨胶与碱性成纤维细胞生长因子混合物,生理盐水组以生理盐水冲洗创面,每组换药1次/d,直至创面愈合,记录创面愈合时间;创面损伤后第3,10天,检测创面愈合率;创面损伤后第7天,实时定量PCR及Western blot检测创面组织血管内皮生长因子、α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原基因及蛋白表达.结果与结论:①创面愈合时间:联合组创面愈合时间比生理盐水组提前了4.5 d(P < 0.05),比白芨组提前了3.0 d(P < 0.05),比细胞因子组提前了2.8 d(P < 0.05);②创面愈合率:联合组创面损伤后第3,10天的创面愈合率均高于其余3组(P < 0.05);③创面组织各基因及蛋白表达:联合组创面损伤后第7天的血管内皮生长因子、α-平滑肌肌动蛋白基因表达高于其余3组(P < 0.05),Ⅰ型胶原基因表达低于其余3组(P < 0.05);蛋白检测与基因检测结果一致;④结果表明:白芨联合外源性碱性成纤维细胞生长因子可促进创面愈合,其作用可能通过促进血管内皮生长因子表达、抑制Ⅰ型胶原表达来完成的.
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14-3-3θ基因过表达载体的构建及其过表达乳腺癌细胞株的建立
目的:为进一步研究14-3-3θ基因对乳腺癌生物学行为的影响,构建14-3-3θ基因真核细胞过表达重组载体并建立其过表达的乳腺癌细胞株.方法:合成的14-3-3θ基因重组在pENTR 3C DUAL载体中,课题组采用DNA重组技术将14-3-3θ基因剪切分离后,插入真核表达质粒载体pcDNA4.0中,重组得到真核过表达载体pcDNA4.0-14-3-3θ,并用其转染293T细胞后用westernblot进行验证,将经过验证的真核过表达载体pcDNA4.0-14-3-3θ转染乳腺癌细胞后用zeocin筛选,筛选出的乳腺癌细胞经过western-blot和PCR验证确为稳定过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞.结果:成功构建14-3-3θ基因过表达真核载体并建立其过表达乳腺癌细胞株,揭示14-3-3θ基因可能在乳腺癌的早期诊断和预后预测中具有重要作用.
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甲状旁腺素(PTH)促骨形成研究及其在口腔种植学中应用的新进展
甲状旁腺素(Parathyroid Hormone,PTH)是利用基因重组技术制造的,与人体天然甲状旁腺素在结构和功能上-致或部分一致的多肽类激素.与其他抑制骨吸收类药物不同的是,PTH可以增加成骨细胞的活性及数量,迅速促进骨形成,为骨质疏松症的治疗及骨质疏松性骨折的预防提供了一个全新的思路.也正是由于其强大的成骨效应,PTH在增加种植体周围骨密度,提高种植体早期固位方面的研究,近年来已经成为人们关注的焦点.
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生物技术制药与基因重组技术研究现状
1 生物技术药物1.1 生物药物与生物技术药物的范畴由于生物技术的崛起和基因工程的发展,提出了生物药物.20世纪90年代将生物药物分为:生化药物、生物制品、微生物药物和生物技术药物.
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人肝再生增强因子基因慢病毒表达载体的构建与鉴定
目的 构建携带人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)基因的慢病毒表达载体,并验证其安全性与有效性.方法 将以人胎肝cDNA为模板扩增得到的ALR与pLenti6/V5-D-TOPO重组慢病毒载体连接后,与慢病毒包装体系ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞,得到携带人ALR基因的慢病毒表达载体病毒颗粒,实时定量PCR法测定病毒滴度;转染BLR 3A大鼠肝细胞,观察细胞生长情况,并用RT-PCR法测定ALR基因表达的方法,验证构建的慢病毒载体的安全性与有效性.结果 扩增产物凝胶电泳、提抽质粒酶切电泳及基因测序结果均显示成功构建携带ALR基因的慢病毒表达载体,测得其病毒滴度为1.48×107 v.p./mL.转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,仅少量细胞病变脱离,转染率为88.49％;RT-PCR结果显示,构建的携带ALR慢病毒表达载体可诱导BLR 3A大鼠肝细胞表达ALR基因.结论 慢病毒表达载体是一种兼具有效性与安全性,且适用于基因研究的病毒表达载体.
关键词： 肝再生增强因子 慢病毒表达载体 BLR 3A大鼠肝细胞 基因重组技术 -
基因治疗在口腔再生医学领域中的研究进展
颌面部的创伤、炎症、肿瘤、先天性畸形等均可造成牙齿、牙周组织、颌骨等口腔颌面部组织器官的缺损.现有的修复手段均存在一定的局限性,难以完全满足临床需要.1995年,Baum[1]首次描述了基因治疗在口腔领域的应用前景.十六年来,随着分子生物学、基因重组技术、再生生物学等基础学科的迅猛发展,基因治疗技术在口腔再生医学领域的应用取得了较好的研究进展,已经成为国际口腔生物学和转化医学研究关注的热点问题[2-6].因此,本文将对基因转移技术以及基因治疗在口腔再生医学临床应用的新进展综述如下.
