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小鼠胚胎肝祖细胞的分离和扩增培养
目的 从胎龄14.5 d的C57小鼠胚胎肝脏中分离、培养小鼠胚胎肝祖细胞(mHPCs), 并将其诱导分化为胆管细胞.方法 用荧光激活细胞筛选法(FACS)分选DLK1表面抗原阳性的小鼠胚胎肝细胞, 并和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)Transwell共培养或者单独培养.细胞免疫荧光检测刚分选和共培养4和6 d的DLK1+细胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)及细胞角蛋白19(CK19)抗原的表达.结果 体外共培养时, 大部分DLK1+细胞分裂增殖明显, 呈葡萄状聚集生长.第4天, 部分细胞开始贴壁增殖, 形态开始变成梭形. 结果 显示, 分选的DLK1+细胞表达AFP和少量ALB, 但不表达CK19;在共培养的第4天其开始表达CK19, 和微弱表达ALB;第6 天, 其高表达CK19, 而几乎不表达的ALB. 结论 应用FACS技术成功从E14.5胎肝细胞中分选出DLK1+细胞并鉴定其大部分为mHPCs, 并可在体外与MEFs Transwell共培养的条件下, 诱导培养其分化为胆管细胞.
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终末期肝病患者乙型肝炎病毒感染与肝祖细胞激活的关系
目的 探讨终末期肝病患者乙型肝炎病毒感染与祖细胞激活和扩增的关系.方法 16例终末期慢性乙型肝炎患者的肝活检标本,以细胞角蛋白(CK7)为标记做免疫组织化学,定量分析祖细胞数目和胆管反应面积的相关性.结果 全部患者均从组织学证实为肝硬化,并且炎症反应严重(炎症活动度评分12～17分).祖细胞数目和胆管反应面积呈显著正相关.血清HBV DNA水平与祖细胞数目和胆管反应面积均显著相关.结论 在终末期慢性乙型肝炎患者中,祖细胞的激活和扩增明显,HBV感染可能参与肝祖细胞的激活和扩增.
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胆管反应在肝癌发生发展中的作用及其临床意义
胆管反应是指在肝祖细胞介导的肝脏修复过程中形成的局部细胞复合体.这种复合体包括有激活的肝祖细胞、中间型肝胆细胞和反应胆管细胞.胆管反应对肝癌发生发展具有重要作用.胆管反应中的肝干/祖细胞的恶性转化和迁移性是肝癌浸润和转移的基础,同时胆管反应又为肝癌的发生发展提供基质微环境.本文就胆管反应的分类、细胞多样性以及胆管反应在肝炎和肝癌发生发展中的作用研究进展进行综述,旨在研究胆管反应对阐明肝癌的发病机制,探索有效的治疗手段.
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肝祖细胞移植对四氯化碳诱导急性肝衰竭小鼠模型肝损伤的修复作用
目的:观察肝祖细胞(HPCs)移植后不同浓度四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝衰竭小鼠模型肝脏修复情况,评价HPCs对肝损伤的修复能力,为评估HPCs移植疗效建立理想的肝衰竭模型.方法:96只ICR小鼠随机分为空白对照组、阴性对照组(0.1％ CCl4组、0.5％ CCl4组、2.0％ CCl4组、10.0％ CCl4组)和实验组(0.1％ CCl4+HPCs组、0.5％ CCl4+HPCs组、2.0％ CCl4+HPCs组和10.0％ CCl4+HPCs组).空白对照组小鼠灌胃给予生理盐水,阴性对照组和实验组小鼠灌胃给予不同剂量CCl4.CCl4造模后1d,将实验组和阴性对照组小鼠常规麻醉后切开腹腔,实验组小鼠经脾脏注射HPCs,阴性对照组小鼠注射等剂量无菌生理盐水.动态观察小鼠生命体征,监测其存活率;采血检测小鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性;取肝脏计算肝脏指数;HE染色观察各组小鼠肝脏组织病理学变化;Hoechst33342标记外源性HPCs,激光共聚焦显微镜检测移植HPCs在肝脏中的分布情况及肝脏标志蛋白细胞角蛋白18 (CK18)和白蛋白(ALB)的表达.结果:与空白对照组比较,0.1％和0.5％CCl4组小鼠存活率、肝脏指数、AST和ALT活性无明显变化(P＞0.05).病理学检测,肝细胞有自我修复作用,HPCs移植治疗的效果不明显.与2.0％CCl4组比较,2.0％CCl4+HPCs组小鼠AST和ALT活性及肝脏指数降低(P＜0.01),存活率增加(P＜0.01);病理学检测可见肝细胞再生和大量外源性肝细胞,CK18和ALB表达与内源性肝细胞相当,HPCs移植治疗有效.10.0％ CCl4组和10.0％ CCl4+HPCs组小鼠2d内全部死亡,无法评估HPCs的治疗效果.结论:HPCs移植可提高急性肝衰竭模型小鼠存活率,改善AST和ALT活性,对肝损伤具有较强的修复能力;且2.0％CCl4诱导的ICR小鼠急性肝衰竭模型能有效反映HPCs移植治疗的效果.
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一种肝脏原位混合型肝细胞-胆管细胞癌小鼠模型的建立
目的 建立一种肝脏原位混合型肝细胞-胆管细胞癌小鼠模型.方法 提取E13.5d小鼠胚胎肝细胞,使用标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)分离出肝祖细胞,使用反转录病毒使之组成性表达c-Myc(T58A突变),进而采用脾注射的方法将1×l06基因操作后的肝祖细胞通过门脉系统递送到受体鼠肝脏汇管区(实验组,6只).脾注射相同数量的野生型小鼠肝祖细胞作为对照(对照组,6只).脾注射8周后处死所有12只小鼠,病理学检查肿瘤发生情况,厚4μm组织切片行免疫组织化学、免疫荧光检查鉴定肿瘤表型.结果 实验组成瘤率66.7％ (4/6),对照组成瘤率0％(0/6);组织学表现符合人类混合型肝细胞-胆管细胞癌特征.免疫组织化学及免疫荧光检查提示肿瘤组织肝细胞标志物白蛋白(ALB)和胆管细胞标志物细胞角蛋白19(K19)的共定位表达.结论 脾注射组成性表达c-Myc(T58A突变)肝祖细胞成功诱导肝脏原位混合型肝细胞-胆管细胞癌小鼠模型.
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白蛋白和角蛋白19双标记胚胎干细胞的建立及其向肝祖细胞的分化
目的 建立白蛋白(Alb)和角蛋白19 (CK19)双标记的胚胎干细胞系,并探讨其在肝祖细胞分化中的应用. 方法 构建含有Alb启动子的绿色荧光蛋白载体,并带有新霉素抗性,同时构建由CK19启动子启动红色荧光的载体,带有潮霉素抗性；将构建好的载体线性化后,同时电转胚胎干细胞El4.1,利用新霉素和潮霉素双筛选后,建立双标记基因修饰胚胎干细胞系El4.1-2；通过拟胚体形成及生长因子(骨形态发生蛋白4和碱性成纤维细胞生长因子)刺激的方法诱导产生肝祖细胞,经过流式细胞术和逆转录-聚合酶链反应检测诱导效率.结果 构建了含有Alb启动子启动绿色荧光和CK19启动子启动红色荧光的载体,并证明了Alb和CK19启动子能特异启动各自蛋白的表达；建立了Alb和CK19双标记胚胎细胞系,并证明其具有多能性,显著表达多能性基因八聚体结合转录因子4和阶段特异性胚胎抗原1,在El4.1-2诱导分化22d后通过流式细胞术分选成功得到21.27％ Alb和CK19双阳性的肝祖细胞.结论 双标记胚胎干细胞的建立可以纯化和定量肝祖细胞,便于改进肝向诱导的方法及研究肝祖细胞特性.
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临床肝胆疾病相关的胆管反应及其意义
胆管反应是一种对肝胆细胞损伤的修复反应,特征病理变化包括小叶间胆管增生、基质变化和炎症细胞浸润.人体肝脏的胆管反应源于肝祖细胞的活化增殖.活化的肝祖细胞、中间型肝胆细胞和反应性小胆管细胞共同组成胆管反应的细胞复合体,该细胞复合体具有肝胆系双重特征,共表达肝细胞和胆管细胞抗原.胆管反应出现在各种急慢性肝胆损伤中,在肝脏再生修复、肝脏纤维化发生和发展、肝硬化形成,以及肝胆管癌的发生和发展中均有重要参与作用.了解胆管反应在各种临床肝胆疾病中的病理学特征、发生和发展机制,及其在肝再生中的作用,可以为进一步发掘肝脏疾病靶向治疗的新途径提供重要参考.
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黄芪总皂苷抑制Notch信号通路抗胆汁性肝纤维化的作用机制
目的 观察黄芪总皂苷对胆汁性肝纤维化Notch信号通路的调控作用. 方法 总胆管结扎制备大鼠胆汁性肝纤维化模型,第2周开始,结扎大鼠随机分为模型组、黄芪总皂苷组和索拉菲尼组(阳性对照),药物干预3周.组织病理方法评价胆管增殖和肝纤维化;检测Notch信号通路活化,即Notch-1,-2,-3,-4、Jagged 1(JAG1)、Delta like (DLL)-1,-3,-4、Hes1、Numb和RBP-Jκ的表达水平.统计学分析采用方差分析,q检验,P＜ 0.05为差异有统计学意义. 结果 与模型组比较,黄芪总皂苷能够显著减少肝脏胶原沉积和肝组织羟脯氨酸的含量(μg/L)(500.15±86.10对比625.72±105.62),P＜ 0.05,差异有统计学意义,明显抑制肝星状细胞活化.与模型组比较,黄芪总皂苷能够显著减少肝组织转化生长因子β1蛋白及mRNA相对表达量(分别为t.02±0.15对比1.89±0.36,1.17±0.18对比1.68±0.29),P值均＜0.05,差异均有统计学意义;显著降低α-平滑肌肌动蛋白的mRNA(1.71±0.57对比2.68±0.46)和蛋白(0.41±0.11对比0.72±0.16)表达;显著增加Smad 7的蛋白表达(0.72±0.008对比0.33±0.001),差异均有统计学意义(P值均＜0.05).与模型组比较,黄芪总皂苷能够减少胆管上皮细胞的增殖,降低CK7、CK8和CK18 mRNA表达,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);显著减少CK19和OV6的阳性面积,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);黄芪总皂苷可显著降低Notch-2,-3,-4和JAG 1mRNA和蛋白表达水平,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);显著提高Numb mRNA(0.90±0.05对比0.75±0.11)和蛋白(1.50±0.15对比0.85±0.11)表达水平,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 黄芪总皂苷可通过抑制Notch信号通路活化干预胆汁性肝纤维化进展,进而抑制胆管上皮细胞的异常增生,提示黄芪总皂苷有可能成为胆汁性肝纤维化的有效治疗药物.
