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近交系小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星DNA鉴定
A与供体细胞完全相同,而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系.结论 体细胞核移植囊胚基因组来源于供体BALB/c小鼠.
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近交系小鼠体细胞核移植胚胎的构建和鉴定
背景:体细胞核移植技术已成功用于多种动物的克隆,但其过程中核移植技术的成功率较低.目的:通过对卵母细胞不同去核方法的对比分析,观察其对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响,并利用微卫星DNA技术进行核移植囊胚鉴定,初步建立小鼠体细胞核移植技术平台.设计、时间及地点:以卵母细胞为观察对象的对比实验,于2005-09/2007-10在广西医科大学医学科学实验中心及动物实验中心完成.材料:选用C57BL/6小鼠卵母细胞为受体、BALB/c小鼠卵丘细胞为供体.取600枚受体卵母细胞,根据去核方法不同分为3组,每组200枚.方法:①盲吸法:吸出卵母细胞第1极体及其附近的适量胞质.②蔗糖辅助去核法:以含蔗糖显微操作液预处理卵母细胞,吸出可见的细胞核等遗传物质.⑨荧光染色去核法:Hoechest33342预处理卵母细胞,在紫外光下用去除遗传物质.乙醇联合二甲氨基嘌呤进行重构胚激活,激活后卵裂培养基液滴中培养.根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物,提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA,使用巢式聚合酶链反应扩增选定的序列.终扩增出4个微卫星位点DNA片段,即D3Mit28,D11Mit258,D12Mit136及D14Mit50.主要观察指标:比较3种去核方法的去核率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数差异.对巢式聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证.结果:①盲吸去核法的去核率、处理重构胚的体外发育能力均低于荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法(P<0.05).②荧光染色去核法的去核率高于蔗糖辅助去核法(P<0.05),两组的囊胚率及囊胚细胞数差异均无显著性意义(P>0.05).③巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA,通过微卫星DNA序列的扩增,证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同,而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系.结论:荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法适用于小鼠核移植,可支持小鼠体细胞核移植胚胎的早期发育.微卫星分析证实体细胞核移植囊胚为供体BALB/c小鼠的克隆,微卫星DNA分析可用于小鼠体细胞核移植囊胚的鉴定.
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改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育
目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育.方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25 mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的少量细胞质.随后,将直径为10～12 mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活.体外培养72 h,对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数.结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15 s;Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核:去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72 h内发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞.结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法.
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不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响
目的研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找佳电融合参数.方法将直径10～12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数.结果电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1 000～2000kV/cm和脉冲时程40～160 ms.低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡.如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异.此外,脉冲重复次数以1～2次为佳.结论优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素.
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激活方法和培养体系两种因素对大鼠-牛异种核移植重组胚胎体外发育的影响
目的:构建大鼠-牛异种体细胞核移植重组胚胎,探讨激活方法和培养体系两种因素对重组胚胎体外发育的影响.方法:采用血清饥饿法同步处理的SD大鼠成纤维细胞为供体细胞,以牛去核卵母细胞为受体,显微直接注射法构建重组胚,在M199成熟培养基中,分别采用透明质酸酶、放线菌酮和6-DMAP+乙醇3种化学激活方法激活重组胚,并分别观察重组胚被放线菌酮激活后在M16、M199和改良的CZB3种培养基中的发育情况.结果:透明质酸酶、放线菌酮和6-DMAP+乙醇激活重组胚胎,卵裂率分别是5.36%、15.42%、17.86%;M16、M199和改良的CZB培养重组胚胎,卵裂率分别是9.09%、16.17%、17.05%.结论:放线菌酮和6-DMAP+乙醇均可有效激活重组胚;M199和改良的CZB均可支持胚胎的体外发育,且二者胚胎培养的效果显著优于M15.
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核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响
目的:探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响.方法:采用血清饥饿法同步化处理的SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞,常规超排KM小鼠获得卵母细胞,采用盲吸法去核,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎,6-DMAP+CCB+乙醇激活重组胚, CZB培养液中培养.结果:电场强度(V/cm)和脉冲(ms)为: 1500/30; 1500/40; 1800/30; 1800/40时,融合率为: 81.5%; 83.3%; 77.6%; 82.0%.直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为33.1%和28.9%,桑椹胚发育率为17.8%和15.5%.结论:电场强度为1500～1800V/cm, 脉冲为30ms或40ms时,都能获得较高的融合率;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高,但统计学分析差异不显著.
