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克隆技术与人生殖医疗
哺乳动物克隆技术可按以下步骤进行.把供体细胞核同受体卵细胞质相融合之后,给予活化刺激,松解细胞骨架并使其停止分裂,再使核基因组加倍.再让其进入分裂细胞周期.之后,和普通胚一样培养,并移植到雌性受体中待其发育出生.该实验操作可根据不同条件情况而调整,其成功率从供体核与受体胞质准备、细胞融合、重组胚的移植到克隆动物的出生,通常为1%～2%.这种技术有许多部分和生殖辅助技术(ART)相重复.
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改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育
目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育.方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25 mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的少量细胞质.随后,将直径为10～12 mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活.体外培养72 h,对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数.结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15 s;Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核:去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72 h内发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞.结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法.
