反义VEGF基因转染对视网膜母细胞瘤细胞VEGF表达的影响

目的研究以腺相关病毒载体的反义血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞中VEGF表达的影响,探讨基因治疗RB的新方法.方法将一定量的反义VEGF基因转染到RB细胞系HXO-Rb44细胞,分别采用免疫组化图像分析和半定量RT-PCR方法,检测转染前后HXO-Rb44细胞中VEGF表达的变化.结果免疫组化显示VEGF蛋白在反义VEGF基因转染后的HXO-Rb44细胞胞浆中的染色强度明显减弱,转染前的VEGF蛋白的灰度值为172.86±15.56,转染后的灰度值为243.41±18.62(灰度值与免疫染色强度成反比),差异有显著性意义(P=0.007).半定量RT-PCR表明VEGF mRNA在转染后的HXO-Rb44细胞中的相对表达量为0.428±0.05,和转染前的表达量0.952±0.02相比,差异有显著性意义(P=0.000).结论反义VEGF基因能显著抑制HXO-Rb44细胞中VEGF的表达,为进一步的动物实验提供了实验依据.

手术缝线携载c-myc反义基因的研究

目的 探讨手术缝线携载c-myc反义基因片断的可能性及可行性.方法 保护薇乔缝线反复浸泡于c-myc反义核酸溶液72 h,溴化乙锭(EB)标记后紫外灯下观察其吸附反义基因的情况.将吸附反义基因的缝线置于生理盐水中于不同时间点以紫外分光光度计测其吸光度(A)值,绘出体外控释曲线.同时取释放液进行电泳分析.结果 吸附核酸的缝线经EB标记后在紫外灯下呈烧红的铁丝样,释放曲线提示2 h即达释放高峰,36 h基本完全释放.电泳则可见随时间延长而逐渐变亮的电泳带.结论 保护薇乔缝线可较大量携载c-myc反义基因片段,并可缓慢释放.

肝细胞癌高表达新基因BC047440功能的研究

目的探讨肝细胞癌高表达新基因BC047440在肝癌形成中的作用.方法通过DOTAPTM脂质体介导的转染技术,将BC047440基因反义真核表达载体导入HepG2肝癌细胞,经G418筛选,获得稳定表达BC047440反义基因的HepG2肝癌细胞,采用半定量RT-PCR检测反义基因对转染细胞的内源性BC047440基因抑制效果,噻唑蓝(MTT)比色法观察转染细胞生长曲线及流式细胞术比较细胞周期的变化.结果转染BC047440反义基因的肝癌细胞内源性BC047440基因受到有效抑制,细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1期细胞比例明显增高.结论肝细胞癌高表达基因BC047440可能是一个新的肝癌相关基因,在肝癌中的异常高表达可能对肝癌的发生发展具有一定的促进作用.

c-fos反义基因对缺血缺氧心肌细胞肌钙蛋白表达的影响

目的探讨c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞肌钙蛋白表达的影响.方法烧伤血清采自30%TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠:采用含1%O2的混和气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建c-fos反义基因重组体;由Lipo-fectamine Kit介导心肌细胞转染;于缺氧复合烧伤血清处理1,3,7h不同时相点采用Western blot检测c-fos蛋白,肌钙蛋白-T(TnT)的表达变化.结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(简称非转染组),c-fos蛋白显著表达,3h达到高峰,与正常对照组比较,TnT表达显著下降,7h降至低水平;转染c-fos反义基因重组体(简称转染组)后,c-fos蛋白表达显著下降,TnT表达却显著回升.结论缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞TnT表达较正常心肌细胞明显减少,当在缺氧复合烧伤血清处理前转染c-fos反义基因后,心肌细胞TnT表达较单纯缺氧复合烧伤处理心肌细胞显著回升,表明c-fos反义基因转染能抑制心肌细胞TnT的表达下降.

真核表达质粒PcDNA3.1-asHpa的构建及意义

目的:构建乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体,探索恶性肿瘤基因治疗的新途径.方法:以质粒pcDNA3.1为载体,将乙酰肝素酶信号密码的DNA片段反向插入其多克隆位点得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体(pcDNA3.1-asHpa).结果:经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因插入方向和插入序列大小正确.结论:成功的构建了乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体,可以进一步用于反义基因表达的实验研究.

正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆正、反义人PIN1基因(hPIN1)及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体.方法应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出990bp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1.结果扩增的cDNA经测秩序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5.3 +0.99kb 两条带,与理论计算值完全一致.结论成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体.

c-jun反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的分子机制研究

目的探讨c-jun反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的分子机制.方法烧伤血清采自30% TBSA Ⅲ度烫伤Wistar大鼠;采用含1%O2的混和气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建c-jun反义基因重组体;由Lipofectamine kit介导心肌细胞转染;缺氧复合烧伤血清处理后12、24和48h不同时相点采用Western blot检测c-jun蛋白,PKCα和JNK的表达变化.结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(非转染组),c-jun蛋白,PKCα和JNK均显著表达,24h达高峰;转染c-jun反义基因重组体(转染组)后,c-jun蛋白,PKCα和JNK表达均明显下降.结论 c-jun反义基因重组体转染通过PKCα和JNK的表达下降对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞起保护作用.

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切.本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡.方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况.结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P＜0.05).激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多.结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡.

通过生存素反义基因加强顺铂在头颈部鳞状细胞癌治疗中的敏感度

EBV-LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的:构建EB病毒LMP1反义基因的真核表达载体.方法:通过PCR方法,扩增EBV-LMP1基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒pcDNA3.1的多克隆位点中.经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体.结果:酶切产物和PCR产物的凝胶电泳显示400bp左右的目的基因片段,测序结果显示与已知LMP1基因序列一致.结论:成功构建了LMP1反义基因的真核表达载体.

人tankyrase 1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的 探讨反义tankyrase 1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响.方法 构建人tankyrase 1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,从光镜、电镜水平观察转染与未转染细胞形态学的变化.结果 与亲本细胞相比,光镜下反义tankyrase 1基因转染的SGC-7901细胞胞体增大,胞浆丰富,核浆比例降低,核分裂象减少,核型变规则;透射电镜下核异型性减少,核膜较规则,细胞器丰富,部分细胞胞质内有微腺腔形成.结论 反义Tankyrase 1基因转染能部分逆转SGC-7901细胞的恶性表型,有促进其分化的作用.

阻断转化生长因子-β1信号传导治疗大鼠实验性肝纤维化

目的观察腺病毒介导的反义Smad4基因阻断转化生长因子-β1(TGF-β1)信号传导后对肝纤维化的治疗作用. 方法将腺病毒介导的反义Smad 4基因导入四氯化碳/乙醇诱导的大鼠纤维化肝脏,用RT-PCR及western方法观察Smad4的表达,并观察肝脏的病理变化和胶原表达.结果纤维化肝脏中Sm a d 4的表达较正常肝脏明显增强,I型胶原增多.经转基因处理后大鼠纤维化肝脏中Sm ad 4的表达明显弱于未治疗的纤维化肝脏,I型胶原减少;且治疗组肝脏纤维间隔也明显减少,纤维化程度明显减轻.结论腺病毒介导的反义Smad4基因能有效阻断TGF-β信号传导系统,减少细胞外基质的产生,从而减轻肝纤维化的程度.

NHE1反义基因对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响

目的:探讨人NHEl反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响.方法:构建人NHE1反义基因真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,通过免疫组织细胞化学SP法检测NHE1蛋白表达情况,流式细胞仪检测对细胞增殖和凋亡的影响,从电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化,并观察裸鼠成瘤能力的改变.结果:转染NHE1反义基因的SGC-7901胃癌细胞NHEl蛋白表达降低;细胞增殖能力下降,细胞凋亡率增加;透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强;裸鼠成瘤能力下降.结论:NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调,裸鼠成瘤能力降低,NHEI蛋白在胃癌细胞生长中起重要作用.

反义hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响

目的探讨人端粒酶蛋白催化亚单位(hTRT)反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响;方法采用脂质体法将hTRT正、反义真核表达载体导入SGC-7901胃癌细胞株中,从光镜、电镜水平观察转染细胞形态学的变化.结果与未转染细胞相比,光镜下hTRT反义基因转染的SGC-7901胞体增大,胞浆丰富,分裂相减少,核浆比增大,异型性减小;透射电镜下反义基因转染细胞细胞器丰富,胞浆内出现分泌泡样结构及胞质内微囊;扫描电镜下反义基因转染细胞表面微绒毛增多,胞体周围可见大量颗粒样物质,根据AB/PAS染色结果,这些颗粒样物质有可能是其分泌的粘液颗粒.结论 hTRT反义基因有促进SGC-7901细胞分化的作用.

反义hTR对人胃癌细胞株SGC-7901恶性表型的逆转作用

目的探讨反义hTR基因转染对胃癌细胞系SGC-7901恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值.方法构建包含端粒重复序列模板区的反义hTR基因真核表达载体,用脂质体法将其转染至胃癌细胞系SGC-7901,比较观察反义hTR基因转染后7901细胞的hTR RNA表达、端粒酶活性、体外生长增殖特性和裸鼠体内致瘤能力的变化.结果反义hTR基因转染的7901细胞hTR RNA表达和端粒酶活性明显降低、体外生长增殖能力降低、接触抑制恢复、细胞凋亡率增加、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内致瘤能力完全消失.结论反义hTR基因转染能使7901细胞的端粒酶活性明显下调并逆转其恶性表型,提示端粒酶是肿瘤治疗的较理想靶点,端粒酶抑制剂具有良好的临床应用前景.

反义IGF-I R基因对肝癌细胞生长的抑制作用

目的:研究反义IGF-IR基因对肝癌细胞株7721细胞生长的抑制作用.方法:利用基因治疗的反义技术,通过脂质体介导将IGF-IR正、反义基因真核表达载体导入人肝癌细胞株SMMC-7721,经潮霉素筛选阳性克隆后,分别采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,MTT法检测细胞生长及软琼脂克隆形成试验.结果:1GF-IR反义细胞与7721细胞IGF-IR正义细胞在前6 d生长趋势无明显变化,第7天后反义IGF-IR细胞生长减慢.反义IGF-IR基因细胞G1/G 2期细胞明显增加,为63.9%,明显高于7721细胞(49.8%);S期减少(1 9.3%),细胞凋亡增加(5.89%),不能在软琼脂中生长,而7721细胞及IGF-I R正义细胞在软琼脂中生长良好.结论:反义IGF-IR基因对肝癌细胞株7721生长具有明显抑制作用.

人TLR4及MD2基因反义真核表达载体的构建

目的构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体,为研究其在肺炎症反应中的作用奠定基础.方法通过PCR技术扩增出TLR4及MD2基因片段,然后分别反向插入真核表达载体pEFBOS的多克隆位点,后对产生的重组子进行酶切和测序鉴定.结果扩增出的TLR4目的片段为2.6 kb,MD2为0.5 kb,并成功地连接到pEFBOS载体上,DNA测序结果也显示插入片段为目的片段.结论成功构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体.

IGF-ⅠR、IGF-ⅡR反义基因对SMMC-7721肝癌细胞生物学行为的影响

目的研究胰岛素样生长因子Ⅰ型及Ⅱ型受体(IGF-ⅠR、IGF-ⅡR)反义基因对SMMC-7721肝癌细胞生物学行为的影响.方法应用反义技术,在已转染了IGF-ⅠR反义基因的肝癌SMMC-7721(7721-IGF-ⅠR-AS)细胞基础上,继续利用IGF-ⅡR反义基因真核表达系统,通过DOTAP脂质体介导的转染技术,将IGF-ⅡR反义基因导入该细胞,经G418及潮霉素双重筛选获得稳定表达IGF-ⅠR、IGF-ⅡR反义基因的7721-IGF-R-AS细胞.采用光镜、电镜观察形态学变化,双层软琼脂克隆形成实验、MTT细胞生长曲线实验及裸鼠皮下接种实验观察转染后细胞体外生长情况.结果 7721-IGF-R-AS细胞在光镜、电镜下的肿瘤细胞形态恶性程度减低;在软琼脂培养基中的生长能力降低(P<0.01);在裸鼠体内的致瘤能力也降低(P<0.05);但细胞生长曲线与对照组比较则无明显差异.结论 IGF-ⅠR、IGF-ⅡR反义基因对SMMC-7721肝癌细胞株的恶性行为有明显抑制作用.利用反义技术干预肝癌细胞生长因子受体基因表达可能给肝癌的基因治疗提供新的途径.

肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体构建及鉴定

目的构建肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体.方法提取人肝癌组织总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440基因cDNA序列,经与pMD18-T simple载体连接,筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的BC047440基因cDNA序列反向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1(+)BC047440AS.结果经RT-PCR获得826 bp含限制性内切酶位点的cDNA片段,T载体克隆后经PCR扩增目的片段、测序,确定该片段为BC047440基因cDNA,进而构建反义真核表达载体pcDNA3.1(+)BC047440AS,并经PCR扩增目的片段,测序确证.结论成功构建了BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1(+)BC047440AS,为进一步研究该基因功能奠定了基础.通过抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)对肝癌组织与癌旁肝组织间差异表达基因进行分离、鉴定,我们发现了1条新的肝癌相关基因cDNA片断(EST)[1],长447 bp,经GenBank检索,90%与已知基因无同源性.进一步采用RACE技术,克隆出该基因的全长cDNA序列[2].经GenBank检索,与近期登录的基因BC047440同源.但该基因是从大脑组织中获得[3],而且国内外少见该基因功能研究的报道.在此基础上,本研究从原发性肝癌组织中克隆了BC047440基因的全长cDNA序列,并构建了其反义RNA真核表达载体,为进一步研究该基因功能奠定基础.

c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理大鼠心肌细胞保护作用的实验研究

目的探讨c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用.方法烧伤血清采自30%TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠;采用含1%O2的混合气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建c-fos反义基因重组体;由Lipofectamine kit介导心肌细胞转染;于缺氧复合烧伤血清处理1,3,7 h不同时相点采用RT-PCR检测c-fos mRNA的表达变化,采用Western blot检测c-fos蛋白,肌钙蛋白-T(TnT)和β-微管蛋白(β-Tubulin)的表达变化.结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(下文称非转染组),c-fos mRNA和蛋白显著表达,3 h达到高峰,与正常对照组比较,TnT和β-Tubulin表达显著下降,7 h降至低水平;转染c-fos反义基因重组体(下文称转染组)后,c-fos mRNA和蛋白表达显著下降,TnT和β-Tubulin表达却显著回升.结论缺氧复合烧伤血清处理产生的c-fos会引起心肌细胞损伤,c-fos反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞具有保护作用.