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c-myc反义寡核苷酸对肿瘤细胞表面抗原和对CD3AK杀伤敏感性的调节作用
目的:观察c-myc反义寡核苷酸上调人高转移性肺巨细胞腺癌PG细胞表面抗原分子的表达水平,提高免疫效应细胞杀伤敏感性的作用和机制.方法:RT-PCR方法检测c-myc muRNA表达水平的变化.MTT法检测细胞增殖活性和CD3AK杀伤活性的变化.流式细胞术检测细胞表面抗原表达的变化以及c-myc蛋白表达水平的变化.结果:c-myc反义寡核苷酸(1 μmol/L)明显地抑制PG细胞c-myc mRNA和蛋白表达水平,显著提高细胞表面HLA-ABC、ICAM-1分子的表达,其表达率分别从68.44%、38.40%增高到83.16%和42.09%(P＜0.01).CD3AK对反义寡核苷酸处理的PG细胞的不同效靶比杀伤活性,分别从40.0%、65.0%、74.0%增高到52.0%、74.0%、91.0%(P＜0.01).结论:c-myc反义寡核苷酸通过抑制PG细胞c-myc mR-NA和蛋白表达,上调PG细胞表面HLA-ABC、ICAM-1分子的表达水平,提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性.
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反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用
目的构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF-7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性.方法应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7的VEGF165表达及细胞生长周期.结果成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF-7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低.结论VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF-7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索.
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基因枪转导K-ras突变反义基因对人胰腺癌细胞生长曲线的影响
目的 探讨基因枪转导K-ras突变反义基因对胰腺癌细胞生长的影响.方法 利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过活细胞计数试剂盒Cell Counting Kit-8和Thermo Multiskan Ascant酶标仪观察K-raa突变特异性反义基因转导后对AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞的生长曲线变化情况.结果 转导K-ras突变特异性反义基因后,突变型AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的生长曲线明显向右下移动.结论 转导K-ras突变特异性反义基因后,具有突变型K-ras基因的胰腺癌细胞系的生长都受到明显抑制.
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含HPV16型反义E7基因的重组腺相关病毒rAAV-HPV16E7AS的包装、纯化及鉴定
目的 利用重组腺相关病毒载体系统,包装含HPV16型反义E7基因重组腺相关病毒rAAV-HPV16E7AS,并进行纯化及鉴定.方法 利用磷酸钙沉淀法,将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞293细胞中,分别合成rAAV-HPV16E7AS和rAAV-lacZ,用斑点杂交法测定重组病毒的滴度,并用重组病毒感染293细胞测定其转染效率.结果 所构建的rAAV-HPV16E7AS和rAAV-lacZ滴度均为1.0×1010个病毒分子/ml,平均转染效率为75%.结论 已成功构建rAAV-HPV16E7AS,为临床预防和治疗子宫颈癌提供新的手段.
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血管内皮生长因子反义基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用
目的 构建反义血管内皮生长因子(VEGF165)基因真核表达载体,分析该基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用.方法 将人VEGF165cDNA反向克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7细胞的VEGF165表达及细胞生长周期.结果 所构建的VEGF165反义基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,VEGF165表达下降,细胞生存率下降,G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,细胞增殖能力降低.结论 成功构建了VEGF165反义基因表达载体,该基因对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用.
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骨桥蛋白反义基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响
目的 探讨骨桥蛋白反义基因(ANOPN)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响.方法 构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3-1-ANOPN、空载体pcDNA3-1(+)和脂质体分别转染MDA-MB-231细胞,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA.RT-PCR法检测转染细胞OPN基因mRNA的转录水平,MTT法检测转染细胞的黏附能力.结果 重组质粒pcDNA3.1-ANOPN经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确.MDA-ANOPN细胞中OPN基因mRNA的转录水平较MDA-vect和MDA细胞明显下降,细胞的黏附能力也明显降低.结论 ANOPN可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附.
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骨桥蛋白反义基因对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤生长及肺转移的影响
目的 探讨骨桥蛋白反义基因(ANOPN)对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤生长及肺转移的影响.方法 构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3.1-ANOPN、空载体pcDNA3.1(+)和等量的脂质体分别转染人乳腺癌细胞系MDA-MA-231,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-veet和MDA,接种至裸鼠,观察肿瘤的生长、转移情况,并用免疫组化法检测肿瘤组织切片中OPN的表达.结果 重组质粒pcDNA3.1-ANOPN经酶切、PCR及测序,证明构建正确.MDA.ANOPN组裸鼠出瘤时间、肿瘤体积及重量较MDA-vect和MDA组均显著降低,肿瘤肺转移灶数量减少,OPN表达较低.结论 ANOPN可抑制裸鼠移植瘤的牛长及肺转移.
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CⅡTA 反义基因体外转染对HLA-Ⅱ类抗原表达的抑制作用的研究
目的:针对同种异体细胞移植的免疫反应主要由HLA-Ⅱ类抗原介导,而CⅡTA基因对HLA-Ⅱ分子的表达起严格且专一性的调控作用,拟通过CⅡTA的反义cDNA抑制细胞表面HLAⅡ分子的表达.方法:以RT-PCR从HLAⅡ抗原组成型表达的Raji细胞株克隆CⅡTA反义片段(arⅡ),插入腺相关病毒载体psNAV中(pAarⅡ).将该质粒通过脂质体稳定转染Hela细胞(pAarⅡH),检测其表面HLAⅡ分子表达,并以RT-PCR检测其CⅡTA、HLA-Ⅱ(DR、DP及DQ)及Ii分子的mRNA水平.结果:pAarⅡH在重组人IFN-γ诱导下,DR、DP及DQ抗原表达分别降低了79±12%、90±15%及40±8%;同时HLA-Ⅱ及Ii分子的mRNA被明显抑制.结论:提示CⅡTA反义基因片段抑制了自身组成型及诱导型表达量,并相应阻止了CⅡTA所调控的基因(HLA-Ⅱ及Ii)的表达,从而为进一步探讨免疫耐受形成及其在组织工程中的应用奠定了基础.
关键词： MHCⅡ类分子转录激活因子 反义基因 同种异基因移植 -
反义基因治疗高血压
治疗高血压新方法--基因治疗,正随着近年来基因转移技术水平的提高和人类基因组计划的提前完成应运而生.高血压的基因治疗分为正义基因治疗和反义基因治疗,本文讨论反义基因治疗高血压的理论基础、治疗策略、面临的问题及前景展望.
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人胰岛素样因子Ⅱ型受体反义基因转染对肝癌细胞生长的影响
目的研究人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(IGF-ⅡR)反义基因对SMMC-7721人肝癌细胞生长的抑制作用.方法构建IGF-ⅡR正、反义基因真核表达质粒,用磷酸钙-DNA共沉淀的方法,导入SMMC-7721人肝癌细胞株,经G418培养液筛选稳定的抗性细胞.采用Northern杂交检测对转染细胞内源性IGF-ⅡR基因转录的作用,观察转染细胞克隆形成率,细胞生长曲线,软琼脂生长能力的变化.结果 IGF-ⅡR反义基因转染肝癌细胞的内源性IGF-ⅡR基因转录受到有效抑制,转染细胞克隆形成率明显降低,并失去在软琼脂上生长能力,但细胞生长曲线无明显变化.结论 IGF-ⅡR反义基因可有效阻断IGF-Ⅱ至IGF-ⅡR的自分泌/旁分泌生长刺激信号环路,一定程度抑制肝癌细胞的恶性表型.
关键词： 胰岛素样生长因子Ⅱ型受体 反义基因 肝癌细胞 -
2＇-O-methyl修饰的混合骨架反义基因应用进展
反义基因(antisense gene)一般由15～25个碱基组成,它是根据碱基互补原理,人工合成特定地与靶RNA或DNA序列互补、且经化学修饰的RNA片断,可以抑制或封闭靶基因表达.反义基因治疗主要方法:①抑制翻译:反义基因与mRNA起始部位发生结合,形成RNA(DNA):RNA二聚体.
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OPN反义真核表达载体的构建及其对肾癌细胞增殖侵袭的影响
背景与目的:骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的过表达和多种恶性肿痛的发展和转移密切相关,然而,在肾癌中OPN所扮演的角色尚未被清楚地阐明.为验证其作为肾痛基因治疗靶点的可行性,本研究通过构建获得OPN反义基因真核表达载体转染人肾癌ACHN细胞,观察其对人肾癌细胞增殖及侵袭的影响.方法:提取ACHN细胞总RNA,RT-PCR法扩增获得OPN目的片段,将其反向克隆到pcDNA3.1(-)质粒中构建OPN反义真核表达载体,并转染人肾癌ACHN细胞.采用半定量RT-PCR法和Western印迹法检测OPN mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测对细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测对细胞周期和凋亡率的影响;软琼脂克隆形成实验和Transwell法分别检测细胞的增殖和侵袭能力.结果:RT-PCR检测OPN mRNA表达量结果显示,转染重组质粒细胞中的OPN mRNA的表达量为0.29±0.04,与转染空质粒细胞的0.86±0.05和未转染细胞的0.88±0.04相比,差异有统计学意义(P<0.05).MTT法检测结果显示ACHN/OPN细胞的生长速度受到抑制;流式细胞检测结果显示ACHN/OPN细胞生长停滞于S期且凋亡率明显升高;软琼脂克隆形成实验及Transwell实验结果显示细胞的增殖和侵袋能力下降(P<0.05).结论:OPN在肾癌ACHN细胞的增殖和侵袭过程中发挥了重要作用,反义OPN基因能抑制肾癌细胞的恶性表型.
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正反义人端粒酶RNA组分(hTR)逆转录病毒真核表达载体的构建
端粒的功能是完成染色体末端的复制,防止染色体免遭融合、重组和降解,其长度的维持是细胞永生化及恶性转化的重要分子基础,而调控端粒长度的关键分子则是端粒酶.端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用.端粒酶RNA(hTR) 作为端粒酶的组成部分决定着端粒的重复序列并参与端粒酶的活化.本研究将反义端粒酶RNA基因插入到逆转录病毒质粒载体PLXSN中,构建真核表达重组质粒PLXSN-hTR,以期重组质粒表达反义端粒酶RNA,从复制、转录、及翻译三个水平发挥作用,调控肿瘤细胞的端粒长度和端粒酶的活性,抑制或逆转肿瘤细胞的恶性表型,为研究和探索基因治疗肿瘤奠定基础.
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反义VEGF 165基因关节腔注射抑制大鼠胶原性关节炎形成的病理观察
目的:观察反义血管内皮生长因子(VEGF)165基因体内转染对大鼠类风湿关节炎形成的影响.方法:Wistard大鼠30只,关节炎诱导2周后随机等分为3组,并分别给予相应处理:A组(关节腔注射100 μl生理盐水)、B组(关节腔注射100 μl空病毒载体)和C组(关节腔注射100 μl反义VEGF165重组腺病毒); 4周后处死大鼠,对关节炎的发病情况、病理评分、X线放射学评分结果进行对比研究.结果:给药4周后,C组大鼠的关节肿胀程度明显轻于A、B组; C组的病理评分低于A、B组;藏红花红染色显示C组关节软骨多糖破坏轻于A、B组.结论:腺病毒介导的反义VEGF基因转染可以有效地减轻胶原性关节炎的症状,减轻滑膜血管翳对关节软骨的破坏和病理改变.
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大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因TA载体构建及其在肾小球系膜细胞表达的实验研究
目的:构建能在真核细胞表达的含大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)反义基因片段的TA克隆载体,并在体外培养的肾小球系膜细胞表达,为进一步研究TIMP-1反义基因片段抑制肾组织纤维化的作用奠定基础. 方法:用RT-PCR法扩增大鼠TIMP-1 cDNA片段(313bp),并将其反向克隆到真核表达载体pCR 3.1中,用脂质体将大鼠TIMP-1反义基因片段导入培养的大鼠肾小球系膜细胞,半定量RT-PCR法检测系膜细胞TIMP-1表达的变化. 结果:①用限制性内切酶鉴定TIMP-1 cDNA片段插入方向,测序结果证实扩增片段为目的片段;②导入TIMP-1反义基因后,肾小球系膜细胞内TIMP-1表达明显减少. 结论:①成功地构建了含大鼠TIMP-1反义基因片段的TA克隆载体;②该载体能在体外培养的系膜细胞中表达;③TIMP-1反义基因片段能有效地阻抑培养的大鼠系膜细胞中TIMP-1的表达.
关键词： 金属蛋白酶组织抑制物-1 反义基因 肾小球系膜细胞 -
骨桥蛋白反义基因重组质粒的构建
目的构建反义骨桥蛋白(OPN)基因重组质粒,以用于肝癌基因治疗的研究.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长骨桥蛋白基因的质粒(pBlueScript-OPN)为模板,将PCR产物反向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,并经酶切鉴定及测序分析.结果重组质粒经酶切后出现913 bp长的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.结论反义骨桥蛋白基因表达质粒克隆成功,为恶性肿瘤的基因治疗提供了一种有效手段.
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FasL的反义基因在肿瘤治疗中的作用
Fas/FasL是近年来研究较多的凋亡和免疫调节分子,在肿瘤的免疫逃逸中占重要地位,这一机制的阐明,对肿瘤的治疗有重要的意义.随着反义基因技术的不断发展,以Fas/FasL为靶点的反义基因研究,因其特异性高,副作用小等优点,被认为是有前途的肿瘤治疗方法之一.该文就目前针对以FasL为靶点的反义基因技术与肿瘤免疫逃逸的相关研究做一综述.
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MMP-9与人黑色素瘤细胞生长相关性的研究
目的利用多种方法检测金属蛋白酶MMP-9基因与人黑色素瘤细胞生长的相关性.方法利用细胞记数、MTT、3H-thymidine掺入实验等方法检测分别转染正义和反义MMP-9CDNA后人黑色素瘤细胞生长速度的改变.结果转染反义基因后WM451细胞生长速度受到明显抑制(P＜0.05);转染正义基因后WM35细胞生长速度受到明显促进(P＜0.05).而运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达,其结果与对照细胞相似.结论反义MMP-9基因使人黑色素瘤细胞的生长能力受到一定程度的抑制,正义MMP-9基因使人黑色素细胞的生长能力受到一定程度的促进.说明MMP-9在人黑色素瘤细胞生长过程中起重要作用.同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达.
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胰腺癌的癌基因治疗
胰腺癌癌基因治疗尚处于实验阶段,主要包括自杀基因、反义基因、免疫基因及抑癌基因替代治疗.
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Na+-H+交换体1反义基因磁性纳米微粒体内靶向治疗胃癌的实验研究
目的 探讨Na+-H+交换体1(NHE1)反义基因磁性纳米微粒体内靶向治疗胃癌的可行性.方法 构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,以氧化铁磁性纳米颗粒为基因转染载体,将NHE1反义基因导入SGC-7901胃癌细胞中,获得稳定表达NHE1反义基因的7901-AS细胞.研究转染细胞形态学变化及体外生长情况.建立裸鼠胃癌移植瘤模型后,进行体内靶向定位实验,观察抑瘤率.结果 7901-AS细胞在光镜、电镜下的肿瘤细胞形态恶性程度降低.出现显著生长抑制现象,细胞增殖指数降低,凋亡指数明显增高(P
关键词： Na+-H+交换体1 磁性纳米微粒 反义基因 靶向治疗 胃癌
