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iNOS基因转染人CD3AK细胞的实验研究
目的构建一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞.方法用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA317中,经G418筛选出抗性克隆.通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.用病毒上清感染人CD3AK细胞.测定CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量及iNOS活性.结果经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒的正确性.G418筛选出16个抗性克隆,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒.NIH3T3细胞测定病毒滴度为2.1×104 CFU/ml.经重组逆转录病毒上清转染后CD3AK/iNOS细胞合成并分泌的NO含量及iNOS活性比CD3AK细胞明显增高.结论逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染.成功构建CD3AK/iNOS细胞,有效提高iNOS活性及NO含量.
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灵芝合剂及CD3AK细胞对肺癌的临床疗效
目的:探讨灵芝合剂与CD3AK细胞合用对肺癌的临床疗效.方法:26例患者随机分为两组.对照组14例,仅接受CD3AK细胞治疗;治疗组12例,在接受CD3AK细胞治疗的同时服用灵芝合剂.治疗后观察临床症状改善情况及生存时间.结果:治疗组的中位生存时间和平均生存时间均明显高于对照组,且复发的时间间隔延长.结论:灵芝合剂与CD3AK细胞合用能增强临床疗效.
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CD3AK细胞治疗恶性脑胶质瘤体外实验
目的提高人脑胶质瘤过继免疫治疗的效果,探索治疗脑胶质瘤的新途径.方法用CD3和rIL-2共同诱导人外周血单个核细胞,诱导、扩增新型抗胶质瘤效应细胞CD3AK细胞,并与LAK细胞在某些生物学方面进行了比较.结果两组效应细胞增殖曲线均于第6天达高峰,峰值可见,CD3AK细胞＞LAK细胞(P＜0.05);CD3AK细胞扩增倍数明显高于LAK细胞(P＜0.05);两组效应细胞于培养的第6、8、10天所测得的杀伤胶质瘤细胞BT325活性可见,CD3AK细胞＞LAK细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论 CD3和rIL-2具有协同增强作用,使CD3A细胞成为较LAK细胞增殖能力、杀伤活性更强的免疫效应细胞,且rIL-2用量减少,有胶质瘤的过继免疫治疗打下了理论基础.
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肿瘤患者自体CD3AK与LAK细胞生物学特性研究
目的:CD3AK细胞是由抗CD3单克隆抗体和IL-2共同激活诱导的肿瘤杀伤细胞.对30例肿瘤患者自体CD3AK细胞及LAK细胞进行了比较性研究.方法:采用MTT法检测CD3AK细胞及LAK细胞的杀瘤活性,应用流式细胞术进行免疫标志物分析.结果与结论:肿瘤患者PBMNC诱导后产生的CD3AK细胞较LAK细胞有更强的增殖能力,但对Raji、K562细胞的生长抑制作用无明显区别;40%～60% CD3AK细胞表达CTL样表型(CD3+CD8+),约40%CD3AK细胞表达NK表型(CD56+).同时亦观察到不同患者的免疫功能存在明显的个体差异.
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CD44反义寡核苷酸对肿瘤细胞表面抗原和对CD3AK杀伤敏感性的调节作用
目的:观察CD44反义寡核苷酸调节人低分化黏液腺胃癌MGC80-3细胞Fas分子和凋亡抵抗基因bcl-2的表达水平,提高免疫效应细胞杀伤敏感性的作用和机制.方法:RT-PCR法检测CD44、bcl-2 mRNA的表达水平.MTT法检测CD3AK杀伤活性.流式细胞术检测细胞表面CD44及Fas、FasL蛋白表达水平.结果:CD44反义寡核苷酸(1.6 μmol/L)处理后,明显地抑制MGC80-3细胞CD44 mRNA和蛋白表达水平,在CD44配体低分子量透明质酸(HA)存在下,使MGC80-3表面下调的Fas分子显著增高,表达率从6.69%提高到16.81%(P<0.01).CD3AK对反义寡核苷酸处理的MGC80-3细胞杀伤活性显著增高,并呈效靶比依赖效应(P<0.01).MGC80-3细胞bcl-2 mRNA的相对表达定量值由1.06降至0.32.结论:CD44反义寡核苷酸可通过抑制MGC80-3细胞CD44 mRNA和蛋白表达,上调Fas分子的表达,下调凋亡抵抗基因bcl-2的表达,并提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性.
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c-myc反义寡核苷酸对肿瘤细胞表面抗原和对CD3AK杀伤敏感性的调节作用
目的:观察c-myc反义寡核苷酸上调人高转移性肺巨细胞腺癌PG细胞表面抗原分子的表达水平,提高免疫效应细胞杀伤敏感性的作用和机制.方法:RT-PCR方法检测c-myc muRNA表达水平的变化.MTT法检测细胞增殖活性和CD3AK杀伤活性的变化.流式细胞术检测细胞表面抗原表达的变化以及c-myc蛋白表达水平的变化.结果:c-myc反义寡核苷酸(1 μmol/L)明显地抑制PG细胞c-myc mRNA和蛋白表达水平,显著提高细胞表面HLA-ABC、ICAM-1分子的表达,其表达率分别从68.44%、38.40%增高到83.16%和42.09%(P＜0.01).CD3AK对反义寡核苷酸处理的PG细胞的不同效靶比杀伤活性,分别从40.0%、65.0%、74.0%增高到52.0%、74.0%、91.0%(P＜0.01).结论:c-myc反义寡核苷酸通过抑制PG细胞c-myc mR-NA和蛋白表达,上调PG细胞表面HLA-ABC、ICAM-1分子的表达水平,提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性.
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中药淫羊藿苷抑制肝癌HepG2.2.15细胞增殖和免疫逃逸作用研究
目的:观察中药淫羊藿苷(ICA)对HepG2.2.15细胞增殖及对CD3AK细胞杀伤活性的影响,探讨ICA对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用,为ICA的开发应用提供新的理论和实验依据.方法:MTT法检测细胞增殖和细胞杀伤活性;流式细胞术检测细胞表面分子表达水平和细胞凋亡率.结果:50 μg/mlICA作用HepG2.2.15细胞48、72小时的增殖抑制作用明显,抑制率分别为22.04%、29.68%(P＜0.05),呈时间依赖效应.HepG2.2.15细胞经ICA处理后,FasL的表达率由16.22%显著下降至8.29%,Fas表达率由0.79%提高到1.70%(P＞0.05).ICA可明显抑制HepG2.2.15细胞诱导Jurkat细胞凋亡,凋亡率从46.66%下降为18.20%.ICA处理HepG2.2.15细胞后,不同效靶比的CD3AK细胞的杀伤活性,可分别由对照组的15.81%、35.04%、42.85%显著提高至42.58%、67.55%、88.93%(P＜0.05,P＜0.01),呈效靶比依赖效应.结论:ICA能有效地抑制HepG2.2.15细胞增殖,并有一定时间依赖效应;ICA可下调FasL的表达,上调细胞表面Fas的表达,对HepG2.2.15细胞诱导的T淋巴细胞凋亡作用有一定阻断,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用;ICA显著增强HepG2.2.15细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性.
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α-Thujone增强CD3AK细胞增殖及杀伤功能
目的:研究α-Thujone对CD3AK细胞增殖及杀伤功能的影响.方法:从人外周血来源的PBNC按常规方法培养成CD3AK细胞,用不同浓度的α-Thujone处理CD3AK细胞,CCK-8法检测CD3AK细胞增殖及其对K562、SW480、HO8910三株肿瘤细胞的杀伤情况.FCM检测经α-Thujone处理后CD3+ CD8+T细胞上CD107a的表达.结果:α-Thujone能显著促进CD3AK细胞的增殖,表现出一定的浓度依赖性.α-Thujone还能促进细胞CD107a的表达和对多种肿瘤细胞的杀伤活性.结论:α-Thujone能促进CD3AK细胞增殖并增强其细胞毒性.
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IL-7与IL-2、PHA或抗CD3联用诱导人外周血LAK细胞的研究
PHA-LAK细胞和CD2AK细胞的活性均优于IL-2培养的常规LAK细胞[1,2].本文分析比较IL-7对PHA-LAK、CD3AK细胞诱导和活性的影响.
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CD3AK细胞不同途径输注时体内的分布
过继输注体外激活的免疫效应细胞以介导体内肿瘤消退或缓解是现代免疫学在肿瘤治疗研究中的重要进展之一。然而，迄今有关临床观察表明其作用有限，究其原因，认为效应细胞不能迁移至靶器官是影响治疗效果的重要因素之一[1]。本研究皆在探讨CD3AK细胞不同途径输注时的体内迁移和分布特征，为临床选择合理的治疗途径提供实验依据。
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CD3AK细胞对耐药白血病细胞的体外净化作用
目的:观察CD3AK细胞对耐药的白血病细胞系及慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)急变患者原代肿瘤细胞的体外净化作用.方法:采用固化的抗CD3单克隆抗体联合小剂量IL-2诱导CD3AK细胞;MTT法观察CD3AK细胞对K562、HL60及其耐药株的细胞毒活性;肿瘤细胞集落培养(tumor colony assay, TCA)观察CD3AK细胞对K562、HL60及其耐药株集落形成的抑制作用;流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测耐药的CML急变患者原代细胞经CD3AK细胞净化后Pgp阳性细胞的比例变化.结果:MT法显示CD3AK细胞在体外对K562细胞、HL60细胞及其耐药株有相似的杀伤作用;集落培养观察CD3AK细胞对HL60细胞株及其耐药株的集落形成均有较强的抑制作用;FCM结果显示耐药CML原代细胞经CD3AK细胞净化后Pgp阳性细胞比例下降23.20%.结论:CD3AK细胞在体外对耐药白血病细胞株及耐药白血病原代细胞均有较强的净化作用.
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逆转录病毒载体介导iNOS基因转染人CD3AK细胞的初步研究
目的构建免疫细胞性一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞.方法用脂质体介导重组逆转录病毒质粒pLNC-iNOS转染入包装细胞PA317中,经G418筛选出抗性克隆.用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度.用病毒上清感染人CD3AK细胞.测定CD3AK/iNOS细胞培养上清中iNOS活性及NO含量.结果脂质体转染后G418筛选出38个抗性克隆,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.2×105cfu/ml.CD3AK/iNOS细胞合成并分泌的NO含量及iNOS活性比CD3AK细胞明显增高.结论成功构建CD3AK/iNOS细胞,并能分泌高浓度NO.
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自身CD3AK细胞与拉米夫定联合治疗乙型肝炎的临床观察
目的:探讨拉米夫定与CD3AK细胞联合治疗慢性乙型肝炎的临床治疗效果.方法:将73例慢性乙型肝炎患者随机分为两组.58例患者接受CD3AK细胞治疗(1疗程回输细胞总数为1.1-8×1010)和每天服用拉米夫定100mg,15例每天单纯服用拉米夫定100mg.结果:73例患者经12个月治疗后,拉米夫定和CD3AK细胞联合治疗组与单用拉米夫定治疗组HBVDNA转阴率分别为86.2%和80.0%,无显著差异.但联合治疗组HBeAg阴转率、eAb转换率、ALT复常率显著高于单拉米夫定治疗组(分别为52.6% vs 14.3%,20.7% vs 7.1%和97.2% vs 84.6%).联合治疗组CD3和CDST淋巴细胞绝对值在CD3AK细胞治疗后均增加在85%以上.结论:拉米夫定联合自身CD3AK细胞过继免疫治疗乙型肝炎可有效提高患者HBeAg阴转率和ALT的复常率;能明显增强患者的细胞免疫功能;缩短拉米夫定对慢性乙型肝炎治疗疗程.
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CD3AK细胞诱导肿瘤细胞凋亡的形态学研究
目的：在光学显微镜和电子显微镜下观察CD3AK诱导肿瘤细胞凋亡的形态学变化。方法：将CD3AK细胞与人卵巢癌细胞株A2780共育24h，然后分别涂片和制成超薄切片观察肿瘤细胞形态学变化特点。结果：在光镜下，可见CD3AK细胞聚积于靶细胞周围，并粘附于靶细胞膜上，可见肿瘤细胞核固缩，细胞体积变小，细胞质均质红染；电镜下，可见凋亡的肿瘤细胞表面微绒毛消失，染色质沿皱缩的核膜下聚积成新月状，细胞质起泡等典型的形态学改变。结论：CD3AK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡。
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CD3AK细胞对恶性肿瘤患者免疫功能的影响
目的 观察恶性肿瘤患者在化疗/放疗期间或间歇期辅以CD3AK细胞治疗前后免疫功能变化.方法 采用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)法测定NK细胞数量及T细胞亚群,MTT法检测细胞杀伤活性.结果 经CD3AK细胞辅助治疗后,患者NK细胞数量,CD3+,CD4+,CD4+/CD8+比值明显升高(P＜0.01),外周血单个核细胞杀伤活性增强(P＜0.05).结论 临床应用CD3AK细胞配合化疗/放疗治疗后,可提高患者免疫功能,且无明显副作用,是肿瘤患者一种较理想的辅助治疗方法.
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DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗对恶性肿瘤患者凝血功能变化的影响
目的:探讨DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗前、后的晚期恶性肿瘤患者凝血功能、D-二聚体及血小板的变化.方法:选择DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗的61例晚期恶性肿瘤患者,在采集细胞前1天内及DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗后的3天内行凝血功能、D-二聚体及血小板的检测.比较DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗前、后的凝血功能、D-二聚体及血小板的差异.结果:DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗后D-二聚体、FDP均较前升高(P＜0.05),差异有统计学意义;PT、PT_INR较治疗前有所升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论:DC、CIK、CD3AK细胞免疫治疗3天内D-二聚体及FDP水平升高,在一定程度上加重晚期肿瘤患者高凝状态或血栓形成的风险.
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人脐血CD3AK细胞生物活性及抗瘤作用的实验研究
目的应用抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)和重组人白细胞介素-2(rhIL-2)共同诱导人脐血单个核细胞以制备CD3AK细胞,动态观察其体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平.方法用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定细胞杀伤活性,间接免疫荧光法分析细胞免疫表型,ELISA双抗夹心法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)的水平.结果脐血CD3AK细胞在第2周增殖能力强,增殖倍数为78.56;培养至第12天的脐血CD3AK细胞杀伤活性高,并对多种靶细胞的杀伤作用显著;表型分析脐血CD3AK细胞属异质性细胞群,培养第7、14天,群体中CD3+、CD8+、CD25+、CD38+、CD16+及CD56+细胞较培养前显著增加(P＜0.01);CD3AK细胞培养至第3天的上清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平明显升高.结论脐血CD3AK细胞是一种具有广谱杀瘤活力且增殖活性强的免疫细胞.本研究为脐血CD3AK细胞的免疫治疗提供了实验和理论依据.
