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TRIM22稳定过表达细胞系的构建及其抗流感病毒的功能
目的 构建稳定表达TRIM22的HEK293T细胞系HEK293T-TRIM22,观察TRIM22蛋白在该细胞内的表达及对流感病毒复制的影响并初步探究其抑制机制.方法 扩增TRIM22基因并与反转录病毒载体进行体外重组连接,经菌液PCR、测序确认后与反转录病毒骨架载体共转染进HEK293T细胞进行包装病毒.用包装的反转录病毒感染HEK293T细胞,感染24 h后用嘌呤霉素筛选稳定过表达TRIM22的细胞,筛选48 h后用Western blot检测TRIM22表达水平;用IAV-LUC病毒检测稳定过表达TRIM22的HEK293T对流感病毒的抑制作用;再用双分子荧光互补实验(BiLC)检测与TRIM22相互作用的流感蛋白.结果 经测序确认目的基因TRIM22成功克隆到载体pQC-XIP中.包装反转录病毒并感染HEK293T细胞,经过嘌呤霉素筛选后,稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞中TRIM22的蛋白表达水平升高(P＜0.05).在稳定过表达TRIM22的细胞内流感病毒复制减弱(P＜0.05).BiLC检测TRIM22与流感蛋白NP有相互作用.结论 稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞系构建成功,TRIM22与NP有相互作用并且抑制流感病毒复制.
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人乳腺癌MCF-7细胞中TRIM22下调NF-κB的表达
目的 研究人乳腺癌细胞中TRIM22对NF-κB表达的影响.方法 通过RT-PCR和Western blot方法检测人乳腺癌细胞系MCF-7和人正常乳腺细胞系MCF-10A中TRIM22和NF-κB在mRNA和蛋白水平的表达差异;构建TRIM22表达质粒,并通过瞬时转染TRIM22表达质粒,使MCF-7高表达TRIM22,再检测NF-κB在mRNA及蛋白水平的变化.结果 TRIM22在人正常乳腺细胞MCF-10A中的表达水平高于乳腺癌细胞系MCF-7,在MCF-7中转染TRIM22表达质粒后,NF-κB的表达量随之降低.结论 在MCF-7细胞中TRIM22可负调控NF-κB的表达.
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抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响
本文旨在探讨TRIM22 C端SRPY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响.以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,扩增出C端SPRY结构域缺失的TRIM22基因片段,并将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1.将野生型和突变型TRIM22真核表达载体分别转染高分化人肝癌细胞株HepG2.通过反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测其蛋白表达水平,并通过间接免疫荧光法检测其亚细胞内定位.结果成功构建了C端SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒.转染HepG2细胞后,TRIM22 SPRY结构域缺失突变体在转录和翻译水平上均与野生型TRIM22无明显差异,但TRIM22 SPRY结构域缺失突变体完全丧失了核定位能力,这为进一步研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中所发挥的作用及机制提供了有益的启示.
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HBV影响TRIM22表达的机制及TRIM22 SNPs
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对肝癌细胞株Huh7细胞TRIM22表达的影响.方法 将Huh7细胞在不同浓度干扰素α(IFN-α)中培养24 h,采用实时定量PCR和Western Blot法检测TRIM22 mRNA和蛋白质表达;将HBV表达载体和空载体分别转染Huh7细胞,然后加入1 000 U/mL IFN-α中培养24 h,检测TRIM22 mRNNA和蛋白质表达.结果 Huh7细胞TRIM22 mRNA基础表达值低,可被IFN-α以剂量依赖的方式诱导表达上调,其中1 000 U/mL IFN-α组TRIM22 mRNA相对表达量为(213.29±43.51),明显高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05);转染HBV载体组TRIM22 mRNA相对表达量为(43.59±9.81),明显低于空载体组,差异有统计学意义(P<0.05);转染HBV载体组TRIM22蛋白质表达降低.结论 IFN-α可诱导Huh7细胞TRIM22表达,而HBV可抑制TRIM22表达.
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基于表位多肽的抗TRIM22抗体的制备及其初步应用
目的 制备抗TRIM22多肽抗体及鉴定其性能.方法 将TRIM22 N端15个氨基酸的多肽(MDFSVKVDIEKEVTC)与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联.免疫新西兰白兔制备抗血清;将TRIM22多肽与Affi-Gel 10偶联制备免疫亲和层析柱,兔抗血清经亲和层析纯化后得到TRIM22多肽特异性抗体;采用ELISA测定抗体效价、Western blot鉴定抗体特异性,并利用该抗体通过间接免疫荧光实验来检测TRIM22蛋白的细胞内定位.结果 获得了抗TRIM22特异性抗体.Western blot结果显示该抗体能特异识别真核及原核表达的TRIM22蛋白.利用该抗体进行的间接免疫荧光实验发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中.结论 该抗体的制备为TRIM22分子的功能研究提供了有力的工具.
关键词： TRIM22 多肽抗体 免疫亲和层析 Western blot 间接免疫荧光 -
TRIM22通过PI3K/AKT信号通路调控胶质母细胞瘤增殖、侵袭和迁移的研究
目的:探讨基因TRIM22在人脑胶质母细胞瘤中的表达及对增殖、侵袭和迁移等生物能力的影响.方法:通过TC-GA数据库分析胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中TRIM22表达水平,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot两种方法分别检测胶质母细胞瘤细胞系U87和U251中TRIM22 mRNA和蛋白表达水平.应用Lipofectamine 3000将2种TRIM22-siRNA分别转染至U87及U251细胞中,再分别通过qRT-PCR和Western blot检测胶质母细胞瘤细胞中TRIM22敲低效率.应用CCK-8法、细胞平板克隆形成实验来评估TRIM22敲低后对于细胞增殖能力的影响;应用细胞划痕实验和Transwell实验检测TRIM22敲低后细胞侵袭和迁移能力的变化.应用Western blot检测TRIM22敲低对PI3K/AKT信号通路蛋白和上皮间质化标记蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)表达的影响.结果:在U87及U251细胞中敲低TRIM22后,细胞增殖、侵袭和迁移都明显减弱,p-AKT(S473)、N-cadherin 、Vimentin表达水平则明显降低,E-cadherin表达水平明显升高.结论:TRIM22可能通过调节PI3K/AKT信号通路调控胶质母细胞瘤增殖、侵袭和迁移能力.
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TRIM22与IL-18的表达与宫颈癌的关系
目的：探讨三结构域家族蛋白22（Tripartite motif containing 22，TRIM22）与白细胞介素18（interleukin 18，IL‐18）在伴有高危人乳头状瘤病毒（high risk human papilloma virus ，HPV）感染的宫颈癌患者组织和血清中的表达，探讨高危 H PV感染后宫颈癌的发病机制，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供实验依据。方法分别采集临沂市妇女儿童医院27名伴有高危HPV 感染的宫颈癌患者，27名高危H PV阳性但病理检查证实不是宫颈癌的患者，以及27名高危 H PV 阴性的健康女性的宫颈组织标本和血清标本，以免疫组织化学染色技术检测 T RIM 22在宫颈组织中的表达情况，用酶联免疫比色法检测血清中干扰素的水平。结果在伴有高危 HPV感染的宫颈癌组、高危H PV阳性的非宫颈癌组、高危 H PV阴性的非宫颈癌组三组人群中，T RIM 22的阳性表达率分别为：33％、66％、85％；宫颈癌组与非宫颈癌的两组之间比较差异有显著性（ P ＜0．05），在非宫颈癌的两组中，高危HPV阳性组与高危 HPV阴性组之间比较有显著差异（ P ＜0．05）。IL‐18在三组研究对象血清中的水平分别为（84．16±17．41）、（43．48±12．19）、（33．53±7．14） pg／ml ，宫颈癌组与非宫颈癌的两组之间比较差异有显著性（ P ＜0．05），HPV阳性组与HPV阴性组之间比较有显著差异（ P＜0．05）。结论 IL‐18的表达与HPV感染和癌症的发生正相关，而TRIM22的表达与高危 HPV的感染和宫颈癌的发生负相关，提示固有免疫参与了高危HPV感染后宫颈癌的发生，IL‐18可能作为宫颈癌早期诊断的生物学标志物。
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乙型肝炎病毒抑制Huh7细胞TRIM22表达的研究
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)是否影响肝癌细胞株Huh7细胞TRIM22的表达.方法 将干扰素α(IFN-α)加入Huh7细胞培养液中共培养,24 h后实时定量PCR、Western blot,分别在RNA及蛋白质水平检测TRIM22表达.然后用脂质体将HBV表达载体pBlue-HBV及空载体分别转染Huh7细胞,再加入IFN-α共培养,24 h后实时定量PCR、Western blot,分别在RNA及蛋白质水平检测TRIM22表达.用t检验比较组间差异,统计学分析采用统计产品与服务解决方案SPSS 16.0软件.结果 IFN-α可在RNA及蛋白质水平诱导Huh7细胞表达TRIM22.转染pBlue-HBV表达载体的Huh7细胞TRIM22表达水平低于转染空载体的细胞.结论 HBV可抑制IFN-α诱导的TRIM22表达,HBV可能通过抑制TRIM22表达而拮抗IFN的抗病毒作用,导致HBV持续感染.
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HIV衣壳蛋白P24与TRIM22在HEK293T细胞中的表达及共定位
目的 观察人类免疫缺陷病毒(HⅣ)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况.方法 以慢病毒载体pLP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至pDsRed-Monomer-N1真核表达载体.经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定.将pDsRed-Monomer-N1-p24与pEGFP-N3-TRIM22载体共同转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP的表达及共定位情况.结果 经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pDsRed-Monomer-N1-p24真核表达载体.通过荧光显微镜检测发现,p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP在HEK293T细胞中存在共定位关系.结论 HIV衣壳蛋白P24与TRIM22存在共定位.
