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MAR提高稳定转化的CHO细胞转基因表达
目的 研究MAR在CHO细胞中对转基因的表达调控作用,为建立稳定高效表达的CHO表达系统奠定基础.方法 将人β-珠蛋白MAR片段顺式克隆到氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因表达盒两侧,构建MAR介导的哺乳动物细胞表达载体,转染CHO细胞,G418筛选稳定表达细胞株,ELISA分析CAT报告基因的表达水平.结果 β-珠蛋白MAR能提高5.5倍转基因CAT的表达水平,并可降低不同细胞转化株之间的转基因表达差异.结论 MAR能提高转基因在稳定转染的CHO细胞的表达.
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构建人csp-B核基质结合区克隆及其介导的反转录载体
背景:核基质结合区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列.大量实验表明,核基质结合区可以作为DNA复制的起始点或调控基因的转录,构建核基质结合区表达载体能提高外源基因表达水平,增强外源基因表达的稳定性及提高转化细胞稳定株的频率等.目的:通过克隆人基因组不同的核基质结合区片段,构建核基质结合区介导的包含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的反转录病毒载体pLXSN-MAR,以探索核基质结合区对基因表达的影响.方法:开放性实验于2007-01/12在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成.自行构建含氯霉素乙酰转移酶报告基因的质粒PLXSN-CAT载体.TaqDNA聚合酶、T_4 DNA连接酶、DNA Marker、限制性内切酶BamH I、凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购于大连TaKaRa公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.以人基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增csp-B核基质结合区序列,克隆入反转录载体PLXSN-CAT中,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.结果与结论:聚合酶链反应扩增的特异性片段长度为931 bp,以此构建的重组质粒命名为PLXSN-CAT-MAR,经BamH I酶切后显示5.9 kb和931 bp左右的两条片段,测序结果与Gen-bank中的人csp-B核基质结合区(Genbank序列号M62716)序列一致,证明人核基质结合区片段已成功克隆到了反转录载体PLXSN-CAT中.提示成功构建了PLXSN-CAT-MAR反转录表达载体.
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人β-干扰素核基质附着区在CHO细胞中对转基因表达的调控
背景:核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列,不仅可影响邻近内源基因的表达,还能克服转基因沉默,提高外源基因的转录与表达.目的:探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成.材料:CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供.含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建.方法:将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用Sac I/Kpn I及BamHI/SalI酶切,连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上,转化E.coliJM109,提取质粒行酶切电泳,将构建好的载体命名为pCAT-MAR,该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区.分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞,提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA,PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因.主要观察指标:ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达.PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上.结果:①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株,pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株.β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍,pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.065 0,PCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.8131.②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段,证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上.结论:β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平,并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性.
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精子发生障碍患者精蛋白基因5′端及3′端核基质结合区的研究
运用PCR、PCR-SSCP、PCR产物直接测序等方法对61例少精子症及无精子症患者的精蛋白基因5端及3′端核基质结合区(Matrix attachment region,MAR)进行了突变筛查.结果发现2例少精子患者在5′端核基质结合区存在PCR-SSCP带型变异,经测序分析发现其碱基序列存在一杂合性改变.
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核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达
目的 建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系.方法 采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR.采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶链反应检测EGFP表达阳性的COS-7细胞比例、荧光表达强度及EGFP基因的转录.通过Southern印迹和质粒还原实验分析质粒DNA在细胞中存在的形式.结果 本实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在.由于EBVR的存在,可以在体外获得EGFP较长时间的稳定表达.IFN-MAR替代OriP后,仍可在体外获得EGFP的稳定表达.结论 MAR修饰的EBV附着体载体可以在体外获得外源基因高效稳定的表达.
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核骨架/核基质结合区及其功能研究的进展
长期以来的研究只能用结合试验来证明核基质结合区(MARs)的存在,对其真正的功能了解甚少.直到近,人们才发现了MARs的一些生物学活性,MARs参与襻环的形成和染色体的高级包装,在真核生物的转录调控和凋亡方面起到了重要作用.对MARs的生物学功能仍在进一步的研究中,本文主要就MARs的结构、在转录调控中的作用及其它一些研究进展作一综述.
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CHO细胞MAR片段的克隆及其逆转录载体的构建
目的 构建重组人促红素(CHO)细胞核基质结合区MAR的逆转录载体.方法 以CHO细胞DNA为模板,采用PCR扩增CHO细胞的MAR序列,克隆人逆转录表达载体PLXSN-CAT中,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定目的 基因.结果 PCR扩增的特异性片段长度为476 bp,以此构建的重组质粒PLXSN-CAT-MAR经BamH Ⅰ酶切后显示为5.9 kb和476 bp左右的两条片段,测序结果与Gen-bank中的CHO细胞MAR基因(Genbank序列号M62716)序列一致.结论 成功构建了CHO细胞MAR片段PLXSN-CAT-MAR重组逆转录表达载体.
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杜氏盐藻核基质的制备
目的:制备盐藻核基质,进而分离核基质结合区(matrix attachment regions).方法:采用体积分数0.5%TritonX-100破碎细胞,体积分数15%Percoll分离盐藻细胞核,二碘水杨酸锂(1ithium diiodosalicylate,LIS)抽提核蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白质成分.结果:分离出了高纯度的盐藻细胞核,电泳分析表明绝大部分核蛋白已被去除.结论:体积分数0.5%TritonX-100能有效破碎盐藻细胞,体积分数15%Percoll可分离高纯度的盐藻细胞核,25mmol/L LIS抽提可除去盐藻绝大部分核蛋白获得核基质.
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表达盒两侧不同核基质结合区序列介导表达载体的构建
目的 构建表达盒两侧含有不同来源核基质结合区(MAR)序列的载体pCCF-Bg,为进一步研究MAR的调控功能提供基础.方法 用限制酶酶切质粒pCCM-in,将切下的interferon-MAR片段连接至表达盒一侧含有globin-MAR的表达载体上,构建表达盒两侧含异源MAR的表达载体pCCF-Bg.结果 酶切及琼脂糖凝胶电泳证实所构建的载体pCCF-βg正确,pCCF-βg表达盒两侧分别含有interferon-MAR和globin-MAR片段.结论 成功构建了表达盒两侧含有不同来源的MAR片段的载体pCCF-βg.
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人珠蛋白MAR序列的克隆与表达载体pCAT-MAR的构建
目的克隆人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment regions, MAR),构建包含MAR及报告基因CAT的哺乳动物载体pCAT-MAR.方法酚/氯仿抽提、乙醇沉淀提取人基因组DNA,根据GenBank报道的序列设计引物PCR扩增人β-MAR,琼脂糖凝胶电泳鉴定,测序,软件分析其序列特征.限制酶酶切,连接至pCAT3-control载体上构建pCAT-MAR载体.结果琼脂糖凝胶电泳PCR扩增出770bp 条带,序列和报道的序列相似性为99.9%,克隆的DNA片段具备典型的MAR特征.酶切及琼脂糖凝胶电泳证明所构建的pCAT-MAR载体正确.结论 PCR克隆了人-β珠蛋白MAR序列,成功构建了包含MAR的表达载体pCAT-MAR.
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异性核基质结合区结合蛋白-1基因在胶质瘤中的表达及其意义
异性核基质结合区结合蛋白-1(SATBI)是一种组织特异性的核基质结合区结合蛋白.近年来研究结果表明SATB1基因异常表达与多种实体性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的转移、侵袭性生长密切相关[1-2].
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不同启动子和MAR组合对重组CHO细胞转基因表达的影响
目的 分析不同启动子与核基质结合区(MAR)组合对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中转基因表达的影响.方法 将β-珠蛋白MAR(gMAR)与人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、猿猴空泡病毒40(SV40)启动子组合,构建两种不同启动子与gMAR组合的表达载体.转染CHO细胞,48 h后观察增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的瞬时表达情况;G418筛选稳定转化的细胞株,流式细胞术分析稳定CHO细胞eGFP基因的表达水平,实时荧光定量PCR(qPCR)分析eGFP基因的相对拷贝数.结果 不含gMAR的表达载体,CMV-IE启动子eGFP表达明显强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子eGFP表达水平,但在SV40启动子中并未表现出提高作用.两侧含gMAR的表达载体比一侧含有gMAR的表达载体CMV-IE启动子eGFP表达荧光强;G418加压筛选后,含SV40启动子的gMAR表达载体eGFP基因表达不稳定,荧光逐渐减弱,因此,后期只对稳定表达eGFP基因的CMV-IE启动子表达载体进行流式细胞术和qPCR分析.流式细胞术检测结果显示,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因表达量比不含gMAR的表达载体分别提高9.85倍和12.94倍;qPCR结果显示,以不含gMAR的载体的eGFP基因拷贝数为1,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因相对拷贝数为3.68和9.25.结论 CMV-IE启动子活性强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子外源基因的表达水平,其机制可能与增加基因拷贝数相关.
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内含子方向对MAR表达载体重组CHO细胞转基因表达的调控作用
目的 分析内含子方向对核基质结合区(matrix attachment region,MAR)表达载体在重组中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中对转基因表达水平的影响.方法 PCR扩增β-珠蛋白MAR,克隆至表达载体上,构建含MAR表达载体,将载体上一段内含子序列酶切正向、反向连接到载体上.酶切和测序鉴定正确后,转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,G418筛选稳定转化的细胞株,ELISA分析氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因的表达水平.结果 具有正向内含子的含MAR和不含MAR的表达载体CAT基因表达水平均高于含反向内含子的表达载体(P＜0.05),反向内含子存在情况下,MAR不能提高转基因表达.结论 在重组CHO细胞中,内含子的方向影响转基因表达水平,正向内含子和MAR能提高转基因表达,反向内含子不能提高转基因表达水平.
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人β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响
目的:研究人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)在不同表达宿主中对转基因表达的影响.方法:通过PCR从人基因组扩增β-珠蛋白MAR,正向克隆至pCAT3-control载体SV40启动子的上游,分别检测在瞬时及稳定表达的情况下,MAR在NIH3T3及Hela细胞中对CAT报告基因的影响情况.结果:在瞬时表达情况下,NIH3T3细胞及Hela细胞中MAR均不能提高CAT基因的表达;在稳定整合的情况下,NIH3T3细胞中β-珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,而在Hela细胞表达水平只提高2.5倍.结论:MAR能在一定程度上提高稳定外源基因的表达水平;MAR的作用与表达宿主相关.
